过量表达细菌的FolC和FolP基因对提高拟南芥叶酸含量的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中文摘要作为供给人体叶酸需求的主要来源之一，植物中的主要作物如水稻、小麦和玉米的叶酸含量 中文摘要 作为供给人体叶酸需求的主要来源之一，植物中的主要作物如水稻、小麦和玉米的叶酸含量 很低。对植物叶酸合成途径调控机理的研究，目前仅对GTP环化脱羧酶(GcHI)有较深入的研 究。本文拟对植物叶酸生物合成途径中的另外2个酶即二氢叶酸合成酶／多谷氨酰胺叶酸合成酶 (DHFS／FPGS)以及二氢喋呤合成酶(DHPS)进行研究，探讨它们在植物(拟南芥)叶酸生物 合成中的作用。在植物中DHFS和FPGS分别由不同的基因编码，而在E．co“中则由FoIC基因 同时编码；DHPS在E．coli中由FolP基因编码，在植物中则由类似的基因编码。将来源于E．coli 的乃fc和FolP基因分别与酵母CoxlV基因的线粒体定位序列连接，并由CaMV 35S启动子驱动。 取得了以下主要研究结果： 1．系统地分析了来源于Kcoli的Fo妃基因的作用：(1)Northernblot和TaqmagRT-PCR分析表 明，来源于E．coR的FolC基因在拟南芥植株中得到了表达。(2)对Fo，C转基因纯系c4．3-3、 C11-6．8和C12．13．1的幼苗植株和幼嫩叶片的叶酸含量分析表明，这3个纯系幼苗植株的叶 酸含量分别为2．23、2．46和2．51 nmol／g鲜重，而对照为1．77 nmol／g鲜重：这3个纯系其幼 嫩叶片的叶酸含量分别是5．07、 5，54和4．31 amoVg鲜重，对照为3．09 nmol／g鲜重。因此 无论是幼苗植株还是幼嫩叶片，转基因纯系的叶酸含量均显著高于对照。(3)mR_NA表达高 的纯系C11-6．8，其叶酸含量也高，而mRNA表达较C11-6-8低的纯系(24．3．3和C12．13．1， 则其叶酸含量也相应低，因此FolC转基因纯系的叶酸含量与FolC基因的mRNA表达量呈正 相关。(4)对转基因纯系其内源DHFS／FPGS编码基因的mRNA表达的定量分析结果表明， 外源FolC基因在幼嫩叶片中的过量表达，并没有促进内源DHFS／FPGS编码基因的表达。 因此外源凡配基因在拟南芥植株中的过量表达，提高了植株的叶酸含量，而且转基因植 株叶酸含量的提高是由于外源而配基因而非内源DHFS／FPGS编码基因作用的结果。 2。 分析了拟南芥野生型植株内源DHFs艉皤s编码基因的表达以及植株不同发育时期叶片的叶 酸含量。Taqman RT-PCR分析表明：内源不同的DHFS／FPGS编码基因其mRNA表达水平不 同，幼嫩叶片中DHFS和FPGS一3的表达量最高：此外，DHFS和FPGS．1、FPGS-2、FPGS．3 的总表达量在幼嫩叶片中最高，具有组织特异性。叶酸的测定结果表明，不同发育时期叶片 的叶酸含量不同。结合内源DHFS／FPGS编码基因的表达分析以及对叶酸含量的分析，结果 显示：野生型植株的叶酸含量与内源DHFS／FPGS编码基因的mRNA表达量呈正相关。 3．FolC转基因植株比野生型植株开花明显提前，但对植株的生长发育没有负面影响，相反，0，c 单拷贝纯系C11-6．1和C12—13．1的单株结荚数和单株干重还明显高于对照植株。 4．Northernblot分析表明，来源于E．coli的FoIP基因在拟南芥植株中得到了表达。对内驴转 基系株系的叶酸测定结果显示，独立株系P26、P45和P49的B幼苗其叶酸含量分别是2．30、 1．63和2．03 nmoVg鲜重，而野生型对照为1．32 nmoVg鲜重，转基因株系的叶酸含量均显著 高于对照。 综上所述，本文首次研究了DHFS／FPGS和DHPS的编码基因对提高拟南芥叶酸合成的作 用，获得以下创新性结果： 用，获得以下创新性结果： 来源于E,eoli的FolC基因在拟南芥植株中过量表达，提高了拟南芥植株的时酸含量，而且 证明了转基陶植株中叶酸含量的提高，是外源FolC基因而非内源DHFS／FPGS编码基因作用 的结果。 ≯ 阐明了植物(拟南芥)的叶酸含量与叶酸生物合成途径中DHFS／FPGS酶的编码基因的raRNA 表达呈正相关，因此，叶酸生物合成途径中的DHFS／FPGS酶对植物(拟南芥)叶酸的合成 起调控作用，而且可以在mRNA水平上起调控作用。 ≯ 来源于E．coti的FotP基因在拟南芥植株中的过量表达，提高了拟南芥植株的叶酸含量，因 此，植物叶酸生物合成途径中的DHPS酶对叶酸的合成起调控作用。 》 对拟南芥植株内源DHFS和FPGS编码基因的mRNA表达分析表明：它们的表达具有组织特 异性。 关键词：拟南芥； 叶酸；DHFS／FPGS：DHPS：FolC；FolP： 生物合成；代谢工程 英文摘要Abstract 英文摘要 Abstra