匍枝根霉p葡糖苷酶的分离纯化及其受产物抑制分析.PDF

DOI：10．13995／j．cnki．11—1802／ts．201604019 匍枝根霉p葡糖苷酶的分离纯化及其受产物抑制分析 孙全霞，汤斌+，李松 (安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖，241000) 摘 要 对匍枝根霉B一葡糖苷酶进行了纯化并研究了葡萄糖、甘露糖、山梨醇和甘露醇对该酶的抑制作用，结 果发现，66．7mmoL／L的葡萄糖和88．9 mmoVL的甘露糖可完全抑制一定酶活力单位的B·葡糖苷酶活力(0．76 Iu)，而山梨醇和甘露醇对B一葡糖苷酶的催化活力没有影响。分析结构发现，葡萄糖和山梨糖、甘露糖和甘露醇 Virtual 结构差异仅在醛基位置，通过MolegroDocker(MVD)软件模拟并分析葡萄糖、山梨醇和纤维二糖与3-葡 糖苷酶的对接模型，发现含有醛基的葡萄糖与纤维二糖在酶的结合区存在两处竞争性结合位点(Asp244和 Asn242)，且两者在该酶活性中心内的全部结合位点上均处于竞争性关系，其中葡萄糖的醛基在与多个活性位点 结合过程中起主导作用；而不含醛基的山梨醇与纤维二糖在该酶的催化中心及外围均不存在竞争性关系，由此 推测可能是葡萄糖分子中的醛基在B．葡糖苷酶受产物抑制的过程中起到了关键性的作用。 关键词 分离纯化；B-葡萄苷酶；抑制；醛基 纤维素酶是由内切葡聚糖酶(endoglucanase，活力¨“；OLSEN等人曾经报道过在0．1mol／L葡萄 EG)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolaseenzyme，CBH) 糖浓度下B-葡糖苷酶仅有30％的酶活力¨“；MAI 和B一葡糖苷酶(B-glucosidase，BG)组成的一种复合等人曾经从链霉菌中克隆表达了一种耐盐耐葡萄糖 酶¨。。内切葡聚糖酶可以随机水解纤维素中的B． 的B-葡糖苷酶BglNH，在0．5mol／L葡萄糖浓度下 1，4-糖苷键旧。1，外切葡聚糖酶可以从还原段或非 还原段将纤维素水解成纤维二糖H]，B．葡糖苷酶进 6 一步将纤维二糖水解生成葡萄糖¨1，在3种纤维素 酶的协同之下使得纤维素最终被水解成可发酵性 2．5mol／L以上的葡萄糖浓度才开始对B．葡糖苷酶的 单糖，在整个水解过程中B-葡糖苷酶是限速酶，是 活力有抑制作用¨引。 纤维素转化成葡萄糖的一个瓶颈¨]。在实际应用 本文从匍枝根霉原菌的发酵液中分离纯化得到 过程中，常常由于终产物(葡萄糖)的积累而引起酶 B-葡糖苷酶(BGLIII)，研究了葡萄糖、山梨醇、蔗糖、 催化产物抑制作用并形成中间产物积累，从而致使 甘露醇和甘露糖对BGLIII酶活力的影响并利用Mo． Virtual 纤维素酶系的协同作用效率大幅下降，这也是纤维 1egro 素酶在生物质能源应用领域存在的一个亟待解决 LIII抑制的机理。有关B．葡糖苷酶受葡萄糖抑制机 的难题。如，TEUGJAS等人研究发现，葡萄糖的积理的研究，对定向改造B一葡糖苷酶并解除葡萄糖对 累抑制了B．葡糖苷酶活性并引起纤维二糖的累积 B-葡糖苷酶的抑制，提高整个纤维素酶的催化效率有 和整个纤维素酶系水解效率的下降[7 着重要的意义。 2。由于B．葡 萄苷酶的来源不同，所以其各个方面的性质也都不 l 材料 相同¨““。LI等人发现，一种新型的B．葡糖苷酶 1．1 菌株 B911269是目前最耐葡萄糖抑制的B-葡糖苷酶， 3．6mol／L葡萄糖浓度下B-葡糖苷酶竞有70％的酶匍枝根霉TP-02(RhizopusstoloniferTP-02)由本 实验室保存；稻草、豆渣、硫酸铵、KH：PO。、MgSO。、 第一作者：硕士研究生(汤斌