海洋低温碱性蛋白酶的制备与基因工程研究-海洋生物专业论文.docxVIP

堂墨里：童璺塑堂盔堂堡主望些笙奎：塑堂堡望堕丝堡鱼堕堕型鱼三茎量苎固三墨堑壅 堂墨里：童璺塑堂盔堂堡主望些笙奎：塑堂堡望堕丝堡鱼堕堕型鱼三茎量苎固三墨堑壅 常用的碱性磷酸酯酶法相比较，采用半补齐技术、处理的连接 产物为完整的共价闭环质粒，不像碱性磷酸酯酶法那样留有缺 口，因而半补齐法的连接产物其转化率不受影响。r‘y‘ ◆用酪蛋白平板法和酶联免疫吸附(ELISA)的活性筛选方 法从基因文库中筛选到一株阳性克隆(命名为pHHl)。序列测 定分析表明，此重组质粒包含有长度为768bp低温碱性蛋白酶 基因的完整的开放读码框架(ORF)和上游基因调控序列。此片 段编码由256个氨基酸组成的酶，计算分子量为33000Dal。通 过Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌YS一9412—130 基因组DNA。并通过构建表达载体在大肠杆菌中得到了表达。夕7一 ◆用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆 菌YS一9412—130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质。(结果 表明：色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基及精氨酸残基均 与酶活性有关，而羧基、巯基与酶活性无关。 本结果有相当的先进性和技术创新性，填补了国内在海洋 低温酶研究领域的一些空白，对加速开发我国海洋生物活性物 质资源有重要的理论和实际意义。厂Y一 关键词： 海洋低温碱性蛋白酶 黄海黄杆菌@曩搿2二=耐 制各工艺 多克隆抗体 基因文库克崔，期籽弘陋表达、 ＼。 洪义国．青岛海洋大学硕士论文．海洋低温碱性蛋白酶的制备和基因工程研究第一章 洪义国．青岛海洋大学硕士论文．海洋低温碱性蛋白酶的制备和基因工程研究 第一章 前 言 第一节碱性蛋白酶概述 碱性蛋白酶(Alkaline protease)指的在pH值碱性范围内水解蛋 白质肽键的酶类，是生命科学中一类重要的生物大分子 (Biopolymer，Biomacromolecule)，它不仅存在于生物体内，而且 随着生物技术(Biotechnology)的迅猛发展，越来越多的在体外通 过各种工程的途径被人工制造出来，造福于人类。无论在揭示生命 奥秘的生化、生理、医学著领域，还是在求得人类生存和发展的保 健、农业、食品和环境等方面都有十分重要的意义。蛋白酶广泛存 在于细菌、放线菌和真菌中。其中以芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究最 为广泛和深入。这种酶可用于制革、丝绸、医药、食品和生物化学 试剂等领域，其最大用途是作为添加剂生产加酶洗涤剂。 1．1生产碱性蛋白酶的菌种 不少微生物可生产碱性蛋白酶(表1．1)，而且一种微生物能产 几种碱性蛋白酶。工业上生产用菌种重要是枯草芽孢杆菌、地衣芽 孢杆菌及短小芽孢杆菌 。我国目前使用的2079地衣芽孢杆菌、 1213地衣芽孢杆菌、嗜碱性短小芽孢杆菌(Alkaliphilic Baeielus Pumillus)B。。等心3。目前也在不断的选育新菌株口“5““”。产碱性 蛋白酶的放线菌较少，主要是链霉菌，产生的碱性蛋白酶耐高温， 很适合于工业生产。 几乎所有的碱性蛋白酶都是胞外酶阳1。从生态上可分为二类： 一类在中性PH才能良好生长并生产碱性蛋白酶，例如枯草杆菌、 地衣芽孢杆菌及短小芽孢杆菌等等；另一类则是嗜碱微生物，它们 只在PH8-10环境中生长和产酶“““1。 1．2碱性蛋白酶的类型 Keay根据酶的作用特点如最适Ph、温度、底物等将不同细菌所 产生的碱性蛋白酶分为三种类型“ ： A型(CarsBerg型)枯草杆菌碱性蛋白酶：由短小芽孢杆菌、 洪义国．青岛海洋大学硕士论文．海洋低温碱性蛋白酶的制备和基因工程研究第一章 洪义国．青岛海洋大学硕士论文．海洋低温碱性蛋白酶的制备和基因工程研究 第一章 前 言 第一节碱性蛋白酶概述 碱性蛋白酶(Alkaline protease)指的在pH值碱性范围内水解蛋 白质肽键的酶类，是生命科学中一类重要的生物大分子 (Biopolymer，Biomacromolecule)，它不仅存在于生物体内，而且 随着生物技术(Biotechnology)的迅猛发展，越来越多的在体外通 过各种工程的途径被人工制造出来，造福于人类。无论在揭示生命 奥秘的生化、生理、医学著领域，还是在求得人类生存和发展的保 健、农业、食品和环境等方面都有十分重要的意义。蛋白酶广泛存 在于细菌、放线菌和真菌中。其中以芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究最 为广泛和深入。这种酶可用于制革、丝绸、医药、食品和生物化学 试剂等领域，其最大用途是作为添加剂生产加酶洗涤剂。 1．1生产碱性蛋白酶的菌种 不少微生物可生产碱性蛋白酶(表1．1)，而且一种微生物能产 几种碱性蛋白酶。工业上生产用菌种重要是枯草芽孢杆菌、地衣芽 孢杆菌及短小芽孢杆菌 。我国目前使用的2079地衣芽孢杆菌、 1213地衣芽孢杆菌、嗜碱性短小