课件：第五章水的卫生细菌学.ppt

测定过程 水样的采集 采集细菌学检验水样，必须按照无菌操作进行；从采样到检验不超过2h；10 ℃以下冷藏不超过6h。 采样器皿必须经过灭菌； 自来水采样应该用酒精灼烧水龙头/酒精消毒，放水3min后取样； 江河湖库水样沉入水下10-15cm，瓶口向水流上游取样。 用作细菌检验的器皿、培养基等均需按方法要求进行灭菌，以保证所检出的细菌皆属被测水样所有。 制备营养琼脂培养基。 营养琼脂培养基成分为：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。 测定过程 以无菌操作方法用1ml灭菌吸管吸取混合均匀的水样(或稀释水样)注入灭菌平皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并旋摇平皿使其混合均匀。每个水样应做两份（平行样），还应另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作空白对照。待琼脂培养基冷却凝固后，翻转平皿，置于37℃恒温箱内培养24小时，然后进行菌落计数。 用肉眼或借助放大镜观察，对平皿中的菌落进行计数，求出1mL水样中的平均菌落数。 测定过程 异养菌平板计数（Heterotrophic Plate Counting，HPC）是采用R2A培养基，20～28℃培养7d，计数能够生长的异养菌。 R2A培养基成分为：酵母浸膏（Yeast extract）0.5g，聚合蛋白胨（Polypeptone or proteose peptone No.3）0.5g，酸水解酪素（Casamino acids）0.5g，葡萄糖（Glucose）0.5g，可溶性淀粉（Soluble starch）0.5g，K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，丙酮酸钠（Sodium pyruvate）0.3g，琼脂15g，超纯水1000mL。 异养菌平板计数HPC 二、总大肠菌群 总大肠菌群是指那些能在37℃ 、24小时之内使乳糖发酵产酸、产气、需氧及兼性厌氧的、革兰氏阴性的无芽抱杆菌。 总大肠菌群的检验方法有发酵法和滤膜法。 发酵法可用于各种水样(包括底泥)，但操作较繁琐，费时间。 滤膜法操作简便、快速，但不适用于浑浊水样。因为这种水样常会把滤膜堵塞，异物也可能干扰菌种生长。 发酵法 初步发酵试验（产酸产气否？） 平板分离（伊红美蓝鉴别培养基-鉴别） 复发酵试验（可疑菌落是否产气菌？） 发酵法-初步发酵试验 配制培养基：乳糖蛋白胨培养液、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液、品红亚硫酸钠培养基、伊红美蓝培养基。 初步发酵试验：在灭菌操作条件下，分别取不同量水样于数支装有三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管)，得到不同稀释度的水样培养液，于37℃恒温培养24小时。 该试验基于大肠菌群能分解乳糖生成二氧化碳等气体的特征，而水体中某些细菌不具备此特点。但是，能产酸、产气的绝非仅属于大肠菌群，还需进行复发酵试验予以证实。 如何判断产酸、产气 产酸——培养基中有酸碱指示剂（1.6%溴甲酚紫乙醇溶液） 乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、蒸馏水 产气——内有倒管（收集气体） 发酵法-鉴别 平板分离：初步发酵试验后，将产酸产气及只产酸的发酵管接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，于37℃ 恒温培养24小时，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。 品红亚硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。 伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。 发酵法-复发酵 复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则取该菌落的另一部分再接种于装有乳糖蛋白陈培养液的试管(内有倒管)中，每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1—3个，于37℃恒温培养24小时，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。 大肠菌群计数：根据证实有大肠菌群存在的阳性管数，查总大肠菌群数检数表，报告每升水样中的总大肠菌群数。 滤膜法 滤膜法 将水样注入已灭菌、放有微孔滤膜(孔径0.45μm)的滤器中，经抽滤，细菌被截留在膜上，将该滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上，37℃恒温培养24小时，对符合发酵法所述特征的菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检。 凡属革兰氏阴性无芽抱杆菌者，再接种于乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨半固体培养基中，在37℃恒温条件下，前者经24小时培养产酸产气者，或后者经6—8小时培养产气者，则判定为总大肠菌群阳性。 三、粪大肠菌群测定 为区别存在于自然环境中的大肠菌群细菌和存在于温血动物肠道内的大肠菌群细菌，可将培养温度提高到44.5℃，在此条件下仍能生长并发酵乳糖产酸产气者，称为粪大肠菌群。