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Threshold 阈值的设置 软件自动设定阈值 对于不同的批次的实验，需要单独设置阈值 因为不同批次的实验，会有不同的指数/对数扩增期 Real Time PCR常用术语 Cycle threshold （又称 Ct值） 扩增曲线与阈值的焦点，对应的带小数点的循环数 This curve crosses the threshold at cycle 23.1 Ct值的获得 自动分析 手动分析 基线决定阈值 阈值决定Ct值 Ct值的获得 基线决定阈值 Linear图里找基线，基线 对应 曲线形状 Ct值的获得 阈值决定Ct值 Log图里找阈值，指数期 对应 阈值 AB 支持3种技术应用 Presence/Absence + + - + Allelic Discrimination End-point 终点检测 Quantitative PCR Real-time 实时检测 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 TaqMan? 化学原理 Taq酶 开始降解探针 嗝! TaqMan? 化学原理 新的序列，新的信号！ SYBR? Green I 化学原理 SYBR? Green I 化学原理 SYBR? Green I 化学原理 SYBR? Green I 化学原理 新的序列，新的信号！ SYBR? Green I 化学原理 非特异结合任意 双链DNA 定量结果不准确 可能产生 非特异性PCR产物信号 SYBR? Green I 化学原理 使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反应产物的特异性 Temperature ? Fluorescence ? 原始图谱 SYBR? Green I 化学原理 使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反应产物的特异性 Temperature ? Fluorescence ? 导数图谱 Real Time PCR化学原理 每个循环之后 理论上，反应管里的目标片断数会加倍。 荧光信号相应成比例增长。 Real Time PCR化学原理 TaqMan?, 还是 . . . SYBR? Green I ? 优点 更高的特异性 不会有引物二聚体干扰 支持多重荧光实验设计 实验方法易于优化 缺点 价格稍贵 优点 价格便宜 大部分基因以及少量样品均适用 缺点 特异性稍差 必须要做 Melt curves 不支持多重荧光设计 实验方法通常需要优化 Real Time PCR实际状态 线形图谱Linear 半对数图谱Log Real Time PCR常用术语 Baseline 基线 定义背景区域: cycle-to-cycle 的范围 Baseline 基线的设置 通常基线起点为 Cycle 3 … Baseline 基线的设置 通常基线终点设置在实验信号脱离噪音信号上升前 Baseline 基线的设置 软件自动设置基线 软件自动为您选定基线区域 Baseline 基线的设置 软件自动设置基线 每个样品单独设置基线。 可以使每个样品拥有 “完美” 基线。 可以照顾到既有高浓度样品也有低浓度样品的实验。 Real Time PCR常用术语 Threshold 阈值 在扩增曲线上，可以调节的一条水平线 告诉软件到哪里获得分析数据 Threshold Threshold 阈值的设置 最佳位置: Xn = X0 · 2n 成立（指数/对数扩增期） Threshold 阈值的设置 软件自动设定阈值 * TaqMan REAL-TIME PCR 什么是Real Time PCR? 实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术 Technology to monitor, in real-time, the PCR amplification of specific nucleic acid targets Real Time PCR是如何实现的? 在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence） Real Time