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第六章 植物基因工程 转基因植物 将外源基因导入植物细胞，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。 抗虫 抗病 抗逆 生产药物 外源基因：选择？克隆？ 植物细胞：受体细胞的种类？ 导入：方法？ 组织培养：（略） 表达外源基因：如何检测、筛选？ 植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物生产的关键 一、高等植物的遗传特性 植物的基本特征: 遗传操作的简易性 能产生大量的后代 整株植物的再生性 不能有效地吸收外源DNA；细胞全能性 染色体的多倍体性 多倍体植物的遗传不稳定性，导致体细胞变异 二、高等植物的基因转移系统 Ti 质粒介导的整合转化程序 植物病毒介导的转染程序(略) 植物细胞的直接转化程序 植物原生质体的再生程序 （一）Ti 质粒介导的整合转化程序 Ti 质粒的结构与功能 双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti质粒（Tumor-inducing plasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。 （1） Ti 质粒的图谱区 整个质粒160 -240 kb T-DNA区、 Vir区、 Con区、 Ori区 （6）、Ti 质粒的改造 除去T-DNA上的tmt，tms和tmr生物合成基因； 除去 Ti 质粒的其它非必需序列， 安装大肠杆菌复制子， 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列； 插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。 ①pGV3850 特点：外源基因不能直接插入，需要借助于pBR322质粒作为中间载体 选择标记 脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素对植物有剧毒！） 最终受体植物的选择标记 位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。 共 整 合 转 化 程 序 ②双元载体（binary vectors） 能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。 双元载体的结构 Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（10kb） 双元载体的转化 基因插入 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。 帮助质粒（ helper plasmid） 受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。 双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒 ，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。 穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆位点、两个T-DNA 双元系统中的 Ti 具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。 接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细胞中。 穿梭质粒可在农杆菌内自主复制 插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。 三、植物细胞的直接转化程序 枪击法 将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430 m / s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。 电击法 将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长 1 - 2 周，再生出整株植物。 融合法 将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。 所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。 植物原生质体的再生程序 四. 转基因植物的基因鉴定 五、植物基因工程的应用 （一）利用转基因技术研究基因的表达与调控 报告基因（reporter gene ）：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。 （二）利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料 （三）植物转基因技术在植物品种改良中的应用 目前植物中常用的报告基因： （1）大肠杆菌的β-葡萄糖苷酸酶（GUS） 该酶能催化许多β–葡萄糖苷酯类物质的水 解，将其与 X–葡萄糖苷酸（X-gluc）保温，产生 蓝色反应，借此可预测报告基因的表达程度。 （2）昆虫的荧光素酶基因 昆虫荧光素和ATP以及表达荧光素酶的植物细 胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生