用于游离循环DNA分离与分析下一代完整测序工作流程.PDFVIP

应用说明 MagMAX游离DNA分离试剂盒 用于游离循环DNA分离与分析 的下一代完整测序工作流程 摘要 目前发现，游离循环DNA (cf DNA)有望成为用于肿瘤细胞 检测和监测的非侵入性材料。由于循环肿瘤DNA在cfDNA 中出现的几率往往较低，因此靶向测序将是一种最佳的突 变检测工具。为了支持cf DNA研究的发展，我们验证了一 套完整的工作流程，包括：(1) 使用Applied Biosystems™ 简介 Mag MAX ™游离DNA 分离试剂盒从血浆中分离cf DNA ， 文献显示，cf DNA有望成为用于肿瘤细胞检测和监测的非 可使用磁力架手动操作，也可使用T hermo Scient if ic ™ 侵入性材料[1, 2] 。由于循环肿瘤DNA在cfDNA 中出现的几 KingFisher™ Flex或KingFisher™ Duo Prime磁粒处理仪自 率往往较低，因此靶向测序将是一种最佳的突变检测工 动操作，(2) 然后使用Ion PGM™系统利用Ion AmpliSeq™ 具。血浆cfDNA在基础和临床研究(包括肿瘤研究) 中应用广 技术的多重分析功能对分离出的cfDNA进行分子鉴定。 泛。但是，一些商品化cf DNA分离试剂盒操作流程冗长， 使用试剂多，并且往往需要通过加热进行蛋白酶K处理和 利用M a g M A X 游离D N A 分离试剂盒分离并经I o n DNA洗脱，因此难以实施。 AmpliSeq™癌症热点组合试剂v2扩增的cfDNA对50个目的 基因具有可重复的扩增子代表性和突变体检测能力，涵盖 现在，下一代测序(NGS)技术的发展使我们可将cfDNA作为 2,800种COSMIC突变。利用MagMAX游离DNA分离试剂盒 液相活检研究应用的生物标记物。要将cf DNA成功用作肿 或者按照分离柱方法分离cf DNA 的效果相近。重要的是， 瘤研究生物标记物，需要有便于实施的模板处理程序，以 使用MagMAX游离DNA分离试剂盒时血浆用量不到分离柱 及可从大量血浆(1– 10 mL) 中高效提取DNA 的方法( 因为血 方法的一半，但分离效果同样相近。饱和研究和二次采样 液中cfDNA浓度很低(10– 1,000拷贝/mL)) 。诸如NGS等技术 显示，Ion PGM系统上cfDNA热点的检测限在1%以下。这 可对大量血浆中包含的少量cf DNA进行浓集和分析，与现 套性能稳定的cf DNA靶向测序分析工作流程兼具样品制备 有方法相比，研究人员能够更快获得更多信息。血液样品 简单、Ion AmpliSeq技术操作简便和Ion PGM系统周转快速 易于获得，提示我们未来可利用cf DNA提取和分析进行肿 等特点。 瘤细胞演化的检测和监测，这将有助于癌症的研究。 材料与方法 结果 循环cfDNA的分离与定量 实验方案概述 从4份正常的无细胞血浆样品中分离cf DNA ，以便研究 在King Fisher Flex 或King Fisher Duo Prime 系统上使用 cf DNA 回收的可重复性和可扩展性以及cf DNA 的富集程 MagMAX游离DNA分离试剂盒进行自动分离，可加快样品 度。使用MagMAX游离DNA分离试剂盒和带24孔深孔头的 处理速度。也可使用磁力架手动处理样品。然后进行靶向 KingFisher Flex磁粒处理仪对来自每份样品的4 mL和10 mL 测序，即通过富集的cf DNA 制备文库和模板，并通过Ion 血浆进行提取。定量时利用Agilent™ 高灵敏度DNA试剂盒 PGM系统测序(图1) 。 评估cfDNA组分，并利用Invitrogen™ Qubit ™ dsDNA HS (高灵敏度)分析试剂盒进行总DNA定量。 为了验证上述方法与N G S 分析的兼容性，我们使用 MagMAX游离DNA分离试剂盒或商品化的分离柱试剂盒(试 剂盒Q)对储存的4份非小细胞肺癌(NSCLC) cfDNA血浆样品 进行提取。从每份血浆样品中各取1 mL ，按照文献所述操 作程序使用试剂盒Q分离cf DNA 。使用Ma