基因转染的虹膜色素上皮细胞治疗RCS大鼠视网膜色素变性的实验研究-眼科学(视网膜)专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 1 ·中文论著摘要· 基因转染的虹膜色素上皮细胞治疗RCS 鼠视网膜色素变性的实验研究 目 的 遗传性视网膜变性是一组以进行性光感受器细胞及色素上皮细胞功能丧失 为共同表现的疾病。目前为止，这些疾病尚无有效治疗方法[1, 2]。全世界有数百 万人因此永久致盲，危害性极大。临床上迫切需要有效措施以改善和维护 RPE 功能，防止感光细胞变性及凋亡，这是多年来全世界范围内一大热点和难点。目 前发现脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）能促进培 养的人和牛的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞分化，通过 自分泌或通过胶质细胞调节视网膜变性中感光细胞的生存，使视网膜细胞存活 [3, 4, 5]。 本研究拟在视网膜变性的 RCS（Royal College of Surgeons）鼠早期进行干 预，将 BDNF 基因转染的虹膜色素上皮细胞（iris pigment epitheium，IPE） (AAV-BDNF-IPE)移植入早期 RCS 大鼠视网膜下腔后，观察不同时期视网膜电 图(electroretinogram, ERG)、视网膜组织 BDNF 表达及视网膜形态变化，分析移 植后 RCS 鼠视网膜改善情况，为临床对由于 RPE 功能障碍以及感光细胞变性引 起的疾病患者提供更多的思路。 方 法 本研究通过以下四部分进行： 第一部分 ：出生后18-22天（3周龄）RCS大鼠48只，雌雄不拘。通过改进 的巩膜外路移植法将AAV-BDNF-IPE细胞移植到RCS大鼠双眼视网膜下腔，术后 观察眼底情况，并行HE染色，观察移植细胞的存活情况。 第二部分 ：SD 正常对照大鼠，按照出生后 3 周龄、6、8、10、12、14 周 龄分组，每周龄组 3 只，共 18 只，RCS 大鼠及 AAV-BDNF-IPE 细胞移植 RCS 大鼠（已在第一部分实验中完成 AAV-BDNF-IPE 细胞移植）各 18 只，按出生后 周龄分组同 SD 大鼠，分别行双眼暗适应 ERG 记录，电生理检查参照国际临床 视觉电生理标准。每次每眼至少检查 3 次，叠加后取波形稳定、干扰小的 ERG 图形，计算 ERG-a、b 波振幅值并进行统计学处理。 第三部分：对照组 RCS 大鼠按照出生后 3 周龄、6、8、10、12、14 周 龄分组，每周龄组 4 只，共 24 只；AAV-BDNF-IPE 细胞移植 RCS 大鼠（已在第 一部分实验中完成 AAV-BDNF-IPE 细胞移植）24 只，按出生后周龄分组同对照 组 RCS 大鼠。分别于相应时间点即手术当天、术后 3、5、7、9、11 周取双眼球， 用酶联免疫吸附法（Elisa）检测视网膜组织中 BDNF 的表达水平，比较分析这 些数据并进行统计学处理。 第 四 部 分 ： 实 验 动 物 及 分 组 同 第 二 部 分 ， 行 电 生 理 检 测 后处死大 鼠，取出双眼球，取视网膜组织进行 HE 染色、TUNEL 染色和免疫组化染色检 测。 结 果 1. 共计 43 只 RCS 大鼠实施了双眼视网膜下腔移植，发生大量 玻璃体积血、广泛视网膜脱离、眼内炎及 误注入玻璃体腔 18 眼。 AAV-BDNF-IPE 细胞成功移植入视网膜下腔 68 眼，手术成功率 79%。 RCS 大鼠视网膜及睫状体部位 HE 染色发现，睫状体及视网膜均缺乏色素 细胞层；AAV-BDNF-IPE 细胞移植到 RCS 大鼠视网膜下腔 5 周后，HE 染色可见 大鼠视网膜下腔有散在存活的褐色上 皮细胞，推测为移植后存活的 AAV-BDNF-IPE 细胞；视网膜或脉络膜内未见明显炎性细胞浸润反应及结构破坏 （Fig.6）。 2. 三组大鼠成功完成暗适应 FERG 记录，从出生后第 3 周到第 14 周， 共记录正常 SD 大鼠 15 只 30 次，未干预对照 RCS 大鼠 15 只 30 次，细胞移植 组 RCS 大鼠 17 只 34 次。 三组大鼠生后 8 周内 FERG 的暗适应最大反应 a、b 波振幅无明显差别，出 生 10 周以后 RCS 大鼠 FERG 的暗适应最大反应 a、b 波振幅均明显降低，与同 周龄正常 SD 大鼠相比显著下降(P﹤0.05)，出生 12 周以后 RCS 大鼠 ERG 波形 呈低平型，未见明显波峰波谷，a 、 b 波模糊。AAV-BDNF-IPE 移植手术组 RCS 大鼠出生后 10 周龄时 b 波仍保持较高水平，尽管细胞移植组 RCS 大鼠 b 波呈现 缓慢下降趋势，但振幅仍显著高于同周龄未干预对照组 RCS 大鼠(12w 和 14w 组 P＜0.05)。 3. 对照组 R