基底硬度及细胞密度对骨髓间充质干细胞骨分化的影响及机理分析-生物医学工程专业论文.docx

中文摘要 中文摘要 重庆大学博 重庆大学博士学位论文 I I PAGE PAGE VI 摘 要 骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）作为成体干细胞中最重要 的一种，是一类具有多向分化潜能（Multiple differentiation potentiality）的细胞， 能够向神经细胞，肌细胞，成骨细胞，软骨细胞以及脂肪细胞等方向分化。因其 多向分化的能力MSCs已成为组织再生、修复的重要种子细胞来源。目前的再生医 学研究认为MSCs在心肌细胞受损后、脊髓损伤、骨损伤等组织修复和再生工程中 发挥重要作用。然而，组织修复与再生研究中所用的生物材料的物理特性及细胞 周围微环境，尤其是基底硬度对MSCs定向分化方面的作用机理，至今仍不明了。 在组织修复与再生研究中，MSCs的定向诱导分化尤为重要，研究证明在复杂 的组织微环境中，影响MSCs分化的因素不仅包括被广泛研究的生物化学因素，还 包括传导力学信号的生物物理因素。不同的基底材料硬度（Matrix stiffness）和接 种的细胞密度（Cell density）是否会调节MSCs分化以及如何影响其分化尚不清楚。 本文着重研究基质硬度对MSCs向成骨和软骨分化的影响，在此基础上探讨不同细 胞密度对其分化的影响，继而研究哪条信号通路在基底硬度诱导MSCs向成骨分化 过程中起主要调控作用。本文的主要研究工作和结果如下： 1. MSCs细胞形态和增殖对基底硬度及细胞密度的响应 通过改变丙烯酰胺（Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide）的比例， 使材料物理硬度控制在约0.5至100千帕之间。软基底上MSCs贴壁面积仅为硬基底 上的40%且应力纤维少而弱。细胞在软硬凝胶上以低密度（1,000个/cm2）和高密度 （20,000个/cm2）培养，结果显示，在低密度培养时，软基底显著抑制MSCs的增 殖速度，且在软基底上P-Rb, P-P70显著降低，P27显著升高；高密度培养时，软硬 基底对细胞增殖造成的差异消失。以上实验说明细胞增殖与基底硬度有关，但在 高密度培养时，基底硬度对细胞增殖的影响消失，软硬基底上的细胞增殖没有显 著差异。 2. 基底硬度和细胞密度对MSCs成骨和软骨分化的影响 成骨分化的标记基 因 Alkaline Phosphatase (ALP), Type I collagen, alpha1 (Col1α1)，Runt-related transcription factor 2 (Runx2)在硬基底（Hard, 40±3.6 kPa）上 mRNA水平明显升高，表明单纯的物理刺激即基底硬度就能促进MSCs的成骨分化, 在 骨 诱 导 培 养 液 中 也 同 样 得 到 以 上 实 验 结 果 ； 另外 软 骨 分 化 的 标 记 基 因 SOX-9(SRY-related high mobility group-box gene 9) ， Aggrecan， Collagen II 和 Collagen X的mRNA水平在软基底（1.6±0.3 kPa）上显著升高，SOX9的蛋白表达在 软基底上明显升高，Alcian blue染色和Collagen II免疫荧光染色结果均显示软基底 更有利于软骨分化。对成骨分化而言，高密度（20,000个/cm2） 培养时成骨分化 的标记基因ALP、Col1α1和Runx2的mRNA水平在软硬基底上无明显差异；而软骨 分化则不受细胞密度的影响，无论高（20,000个/cm2）、低密度（1,000个/cm2）培 养MSCs，SOX-9，Aggrecan和Collagen X的mRNA水平均在软基底上明显升高。本 实验结果表明在组织工程应用中，低密度和硬基底培养有利于促进MSCs向成骨分 化；软基底培养则有利于促进软骨分化，且此过程与细胞密度无关。 不同硬度基底上 RhoA 和 Rho-kinase (ROCK)及微管抑制剂对 MSCs 的影响 通过对MSCs转染RhoAV14(constitutively active form of RhoA with GST tag)、加 入Rho激酶特异性抑制剂Y-27632及微管抑制剂Paclitaxel，观察MSCs细胞形态变 化、细胞增殖及细胞活性和成骨标记基因的表达。结果显示，转染RhoAV14刺激 ERK磷酸化增强，促进MSCs增殖且上调软基底上成骨标记基因的表达。Y-27632 影响细胞粘附，F-actin由中间均匀分布变为中间荧光微弱，仅有边缘荧光，同时 Y-27632 降低 成 骨分化标记基因 的表达 ， 上 调 软 基 底 上 神经元分化标记 β3 tubulin(TUBβ3)基因的表达。Paclit