基底硬度与炎症因子TGF-β1对气道成纤维细胞生物学与力学行为影响的研究生物医学工程专业论文.docx

中文摘要 中文摘要 重庆大学博 重庆大学博士学位论文 I I PAGE PAGE VI 摘 要 哮喘是一种严重的呼吸系统疾病。在哮喘中不仅存在气道炎症，并且还存在 气道组织的重塑（airway remoldeling）。在气道重塑中，气道壁增厚，上皮下纤维 化，成肌纤维细胞（myofibroblasts，MF）和平滑肌细胞﹙airway Smooth muscle cell， ASMC﹚过度增生。气道成纤维细胞不仅是气道的结构细胞，其在气道组织中的增 值、迁移与分化等行为与气道重塑的发展过程密切相关。已有研究表明，在转化 生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的诱导下，气道成纤维细胞 可以向成肌纤维细胞分化。成肌纤维细胞的超微结构介于成纤维细胞和平滑肌细 胞之间，并且也表达平滑肌细胞的特征性蛋白 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），有人推测成肌纤维细胞是成纤维细胞向平滑肌细胞转分化的过度 形态。此外，在气道重塑中， 由于成肌纤维细胞过度合成和分泌 细胞外基质 （excellular matrix，ECM）蛋白，从而导致细胞外基底膜增厚和基底硬度增加。 然而，细胞外基底硬度的增加能否影响气道成纤维细胞的增殖、迁移等生物学行 为，能否影响炎症因子 TGF-β1 诱导下的气道成纤维细胞向成肌纤维细胞的分化以 及分化细胞的力学行为，从而加重哮喘的发病，至今并未被研究过。 为了研究这个问题，本课题以 SD（Sprague Dawley）大鼠气道成纤维细胞作 为实验载体。首先，人工合成不同硬度的 PDMS（Polydimethylsiloxane，PDMS） 基底，杨氏模量分别 1 kPa、10 kPa、50 kPa；其次，原代培养和鉴定大鼠气道成 纤维细胞。然后，将大鼠气道成纤维细胞接种在不同硬度的基底上，测量基底硬 度对气道成纤维细胞形态、黏着斑、增殖和迁移等生物学行为的影响。最后，将 大鼠气道成纤维细胞接种在不同硬度的基底上，并用 10 ng/mL 的 TGF-β1 诱导其 向成肌纤维细胞分化。测量基底硬度对 TGF-β1 诱导的气道成纤维细胞向成肌纤维 细胞分化的影响以及分化细胞力学行为的影响。本文的主要研究内容和结果如 下： ①基底硬度对气道成纤维细胞形态、黏着斑、增殖与迁移等生物学行为的影 响：用相差显微镜观察并记录基底硬度对气道成纤维细胞粘附形态的影响；免疫 荧光法检测基底硬度对气道成纤维细胞黏着斑（vinculin）的影响；细胞计数法测 量不同硬度基底上气道成纤维细胞的生长曲线；MTT法检测基底硬度对气道成纤 维细胞增殖活力的影响；划痕法检测基底硬度对气道成纤维细胞迁移的影响。研 究发现，基底硬度对气道成纤维细胞的生物学行为有重要影响。首先，不同硬度 基底上的气道成纤维细胞的粘附形态明显不同。基底硬度越高，气道成纤维细胞 的铺展面积越大、细胞长短径比值越高；其次，免疫荧光检测结果显示，基底硬 度对气道成纤维细胞黏着斑（vinculin）的形成有影响作用，基底硬度越高，黏着 斑（vinculin）的大小越大；然后，不同硬度基底上的气道成纤维细胞的生长曲线 显示，在细胞未长至融合状态时，基底硬度越高，气道成纤维细胞的生长速度越 快；另外，MTT试验的结果表明，将气道成纤维细胞接种于不同硬度基底上24 h、 48 h和72 h后，细胞的OD值均有极显著性差异（P0.01），基底硬度越高，气道成 纤维细胞的增殖活力越高；最后，划痕法测量细胞迁移的结果表明，将不同硬度 基底上的成纤维细胞划痕处理12 h、24 h后，细胞的迁移率也具有极显著性差异 （P0.01），细胞外基底硬度越高，气道成纤维细胞的迁移能力越强。 ②基底硬度对 TGF-β1 诱导的气道成纤维细胞向成肌纤维细胞分化的影响：用 PR-PCR 法测量基底硬度对分化的细胞中 α-SMA 和 I 型胶原（collagen I）mRNA 表达的影响；酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检 测基底硬度对分化过程中细胞分泌到胞外基质中 collagen I 蛋白表达的影响； Western blot 检测基底硬度对分化的细胞中 α-SMA 蛋白表达的影响。研究发现，基 底硬度能促进气道成纤维细胞向成肌纤维细胞的分化。首先，PR-PCR 的结果表明， 和硬度为 1 kPa 基底上分化的细胞相比，硬度为 10 kPa 基底上分化的细胞的 α-SMA 和 collagen I mRNA 的表达量分别增加了 0.14 和 0.32 倍。而在硬度为 50 kPa 的基 底上分化的细胞的 α-SMA 和 collagen I