家蚕BmNAT基因的克隆、表达分析 及乙酰化研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

浙江理工 浙江理工大学硕士学位论文 家蚕 BmNAT 基因的克隆、表达分析及乙酰化研究 万方数据 万方数据 本研究由 国家重点基础研究发展计划“ 973 ”项目 （ N o . 2 0 1 2 C B 11 4 6 0 0 ） , 浙江省自然科学基金项目 （ N o . LY 1 6 C 1 7 0 0 0 2 ） 提供资助 摘要 N-乙酰基转移酶（N-acetyltransferase, NAT，EC ）是一种催化乙酰基 团在乙酰辅酶 A 和胺之间转移的酶。昆虫 NAT 主要与色素沉积、生理节律、几 丁质的合成、杀虫药物的设计等有关。家蚕（Bombyx mori）是继果蝇之后又一 典型的鳞翅目模式生物，还能作为生物反应器生产一些重要的药用重组蛋白。目 前对家蚕 N-乙酰转移酶基因（Bombyx mori NAT, BmNAT）的研究还比较少，关 于 BmNAT 基因在家蚕中的基因调控机制还没有相关报导。 我们根据已公布的家蚕 N-乙酰基转移酶基因（Bombyx mori NAT, BmNAT） 序列进行了生物信息学分析，该基因序列全长 1690 bp，ORF 为 1065 bp，编码 355 个氨基酸残基，分子量大小为 39.894kDa（GenBank 登录号：XP_004932777.1）， 等电点 pI 为 5.609；多序列比对的同源性分析表明，BmNAT 与同是家蚕微管组 织的其他 BmNAT 蛋白同源性较高，而与其他昆虫或者高等动物的 NAT 同源性 较低，与 BmNAT（GenBank 登录号：XP_004932776.1）的同源性最高；与玉带 凤蝶（ Papilio polytes） 同 源 蛋白 同 源性 最低 。 通 过构 建 原核 表达 重 组 质 粒 pET28a-BmNAT，在大肠杆菌中表达融合蛋白，将重组质粒转化 BL21（DE3）， IPTG 诱导表达后，经 SDS分析，在 43 kDa 左右有一条特异性蛋白条带， 与预期大小（融合标签 3.56 kDa，BmNAT 39.894 kDa）相符。经纯化蛋白并免 疫新西兰兔制备多克隆抗体，间接 ELISA 测定抗体效价达到 1：12800 以上， Western blotting 检测发现抗体特异性较高。分别提取家蚕各发育时期和五龄幼虫 各组织的总 RNA 和总蛋白，qRT-PCR 和 Western blotting 检测 BmNAT 在家蚕各 时期和各组织的表达情况，分析 BmNAT 的表达谱。结果表明，BmNAT 在家蚕 头部、蛾期、卵期的表达量较高，初步推断 BmNAT 可能在这些组织或时期中发 挥一定的功能。亚细胞定位显示 BmNAT 主要存在于细胞质和细胞核中。通过构 建重组真核表达载体 pIEx-1-BmNAT，转染进入 BmN 细胞，过表达 BmNAT 蛋白， 流式细胞术检测结果显示 BmNAT 对细胞周期可能存在一定的影响。前期研究表 明，BmNAT 存在乙酰化修饰，我们通过定点突变、免疫沉淀和 Western blotting 检测，进一步证实了 BmNAT 的乙酰化及其修饰位点。本研究首次证实家蚕乙酰 化酶本身的乙酰化修饰，为认识家蚕新的基因翻译后修饰调控机理打下基础。 关键词：家蚕；N-乙酰转移酶；表达谱；亚细胞定位；流式细胞术；免疫沉淀 I Abstract N-acetyltransferase (NAT) is a kind of enzyme that catalyzes the transfer of acetyl group between acetyl-coA and amine. The NAT in insect is mainly involved in the pigmentation, control of circadian rhythm, the biosynthesis of chitin, pesticides design and so on. Bombyx mori is a typical model leppidoptera insect, and it also can be used as bioreactor for production of recombinant protein. At present, the related reports about NAT in Bombyx mori are rare. The regulation mechanism about gene BmNAT has not been reported. According to the released Bombyx mori NAT gene in GenBank, we f