获得性重型再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞穿孔素基因突变检测及mRNA表达分析-临床医学;内科学血液病专业论文.docxVIP

天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的检测获得性重型再生障碍性贫血(S从)患者外周血淋巴细胞基因组DNA 穿孔素基因(PRF)编码序列突变形式及rs882822 SNP位点基因型、等位基因 分布特点；检测SAA患者外周血淋巴细胞穿孑L素mRNA表达水平，探索穿孔素基 因与SAA发病之间的相关关系。 方法应用聚合酶链反应(PCR)方法扩增3l例SAA患者及15名正常对照外周 血淋巴细胞基因组DNA穿孔素基因(PRFl)外显子2(EXON2)及外显子3(ExoN3)， 双脱氧终止法测序，用generunner软件将所得序列与GenBank报道序列核对寻 找基因突变位点；发现有突变序列将基因组克隆入M13噬菌体载体中，对所得 两条染色体相应序列分别测序，以确定不同突变在染色体上的分布；根据测序 峰图核对rs885822 SNP位点基因型分布，应用卡方检验统计方法计算rs885822 SNP位点基因型分布是否符合遗传平衡(哈代一韦伯格平衡)，应用卡方检验方法 计算rs885822 SNP位点基因型及等位基因频率在SAA患者和正常对照是否存在 差异；应用逆转录PCR(RT—PCR)方法提取SAA患者外周血淋巴细胞mRNA，PCR 扩增穿孔素mRNA，琼脂糖凝胶电泳，gel pro软件进行半定量分析。独立样本T 检验方法比较SAA患者与正常人外周血淋巴细胞穿孔素mRNA表达是否存在差 异。 结果：通过对31例SAA患者及15名正常人的外周血淋巴细胞基因组DNA穿孔素 基因外显子2和外显子3直接测序，在一例女性SAA患者发现有822位CT碱 基突变，突变类型为纯合子突变，此碱基突变对氨基酸序列无影响。在一例男 性SAA患者，发现907位GA碱基突变，突变类型为杂合子突变，对氨基酸序 列的影响为303位甲硫氨酸变成缬氨酸(Met303Val)。在正常人中没有发现存 在突变样本；发现一处单核苷酸多态性位点(SNP)此位点已由SNP数据库报道， 编号rs885822。此位点的分布符合哈代一韦伯格平衡(P0．05)，此位点基因型 及等位基因频率分布在病例组与对照组之间有明显差异(P=O．016，P=O．021)； SAA初治患者与正常对照比较外周血淋巴细胞穿孔素mRNA表达有明显差异 (P=O．048) 结论：穿孔素基因在中国SAA患者中存在一定比例的突变，rs885822 SNP位点 基因型及等位基因频率分布在SAA患者与正常人比较有差异，穿孔素基因突变 天津医科大学硕士学位论文可能是部分$AA患者患病的遗传易感因素；SAA初治患者与正常对照比较其外周 天津医科大学硕士学位论文 可能是部分$AA患者患病的遗传易感因素；SAA初治患者与正常对照比较其外周 血淋巴细胞穿孔素mRNA表达有明显差异，穿孔素可能是SAA发病的重要原因之 关键词：贫血再生障碍性穿孔素基因突变 Ⅱ 天津医科大学硕士学位论文Abstract 天津医科大学硕士学位论文 Abstract objective：This study was to investigate the mutations and mRNA expression of pc奠forin gene of the patients惭t11 severe aplastic anemia(SAA)and explore the rdationship between perforin and the pathgenesis of SAA． Methods：Exon2 and exon3 of perforin gcnc mutation in Peripheral mononuelear cells of aplastic anemia patients were analysed by DNA direct sequencing，sequences were compared with the Genbank reported reference sequences．The genotype and allele frequency of rs885822 SNP site between SAA patients and normal controls were compared谢t11 chi—square test；Perforin mRNA expressing level in Peripheral mononudcar cells of aplastic anemia patients were analysed by reversexl-transcript PCR method，and compared with independent t test． Resu