鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究-兽医病理学专业论文.docxVIP

博士学位论文 博士学位论文 鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究 摘 要 本研究从国内分离鉴定了鸡传染性法氏囊病超强毒，并将其成功地培育、致弱，揭示 了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白Vp2基因序列的变化过程， 同时得到了能在鸡胚成纤维细胞上增殖的、具有较强致病性的超强毒株和具有较好免疫原 性的致弱株。将超强毒的vp2基因经毕赫氏(Pichea)酵母表达系统进行高效表达，表达 蛋白具有良好的免疫原性，以其为免疫原成功研制了亚单位疫苗。研究成果将为IBD的 有效防制提供先进的、可靠的技术支撑。 ／本研究参与中国一欧盟合作项目(ERBlCl8CT980330)：“鸡传染性法氏囊病的流行 病学、病毒基础及疫苗的改进”。按OIE及欧盟标准，将从我国广西IBD发病鸡群中分离 的IBD野毒，经致病性、抗原性及基因序列分析等三个方面的研究鉴定，确定其为／BD 超强毒株。该毒株对4周龄SPF鸡的致死率为60％以上，抗原性试验和序列分析表明， 其具有超强毒的特征，并且与欧洲标准超强毒UK661的亲缘关系较近，主要结构蛋白核 苷酸同源性为99％，氨基酸同源性为100％。在合作研究中，欧盟研究人员与中国研究人 员共同确定其为wIBDV中国标准株，命名为wIBDV．GX。为我国IBD与IBDV的研究 提供了与国际接轨的标准。 对wmDv如x株进行了SPF鸡胚的快速培育及细胞传代致弱，对各代次细胞毒进行 了序列分析和生物学实验，发现细胞毒在第7代以前，Vp2基因序列没有改变；细胞毒第 8代，有个别核苷酸发生了改变，但没有影响氨基酸序列；细胞第9代，具有超强毒特征 的第222位的丙氨酸和七肽区中第三个丝氨基酸变成了具有弱毒特征的脯氨酸和精氨酸； 10代细胞毒的Vp2基因序列与欧洲标准弱毒氨基酸序列同源性在97％以上，再继续传至 20代，Vp2基因序列基本上没再发生改变。生物学实验也表明，细胞5代毒具有超强毒 的特征，接种4周龄SPF鸡，死亡率达60％：而20代毒对鸡无致病性，在鸡体内连续传 代6代不返强。5代毒和20代毒均可在鸡胚成纤维细胞上增殖，毒价均达到2．0×10SPFU／ml 以上。本研究证明，超强毒经过培育，可以由超强毒株演变为不稳定的中间株，再继续演 变为稳定的致弱株。5代毒灭活后，仍具有较好的免疫原性。1千万PFU／只的剂量的灭活 毒接种SPF鸡，可使免疫鸡对超强毒的保护率达到100％。20代毒对鸡无毒力，却有较强 的免疫原性，接种后，可使免疫鸡产生特异性抗体，抗体阳性率达100％，并能有力地抵 抗超强毒的攻击。本研究中培育的细胞5代毒可以作为灭活疫苗的种毒，20代毒可以作 为弱毒疫苗的种毒。 用OLIGO软件设计引物，以插入wmDv如x Vp2基因的PUCl9为模板，扩增出 1．5KB的片断：将此片断亚克隆到酵母表达载体(PpiczA)．．上，将构建好的载体(PpiczA-Vp2) 用Sacll线性化后，转染酵母GSll5细胞；经PCR鉴定、表型鉴定，筛选酵母重组子， SDS—PAGE电泳，在41KD处出现表达蛋白带；经小规模甲醇诱导表达，筛选出高表达菌 株，经调整、优化诱导时间、温度、摇动培养的转速、甲醇含量等各项技术参数，在温度 28C、转速220rpm、甲醇含量O．5％的条件下，诱导120小时时，表达蛋白的琼扩试验出 博士学位论文 博士学位论文 鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究 现特异性沉淀线，Dot-ELISA试验出现特异性颜色反应，表达量达到26％，属于高效表达。 表达蛋白与白油佐剂以1：1．5的比例乳化，制成亚单位疫苗，免疫SPF鸡后，可产生特 异性抗体，0．3n吲只的剂量免疫后，中和抗体滴度可达l：1000以上，并可保护免疫鸡抵 抗wlBDV的致死性攻击，保护率达90％。 关键词：鸡传染性法氏囊病超强毒，培育致弱，Vp2基因，酵璺表达， 亚单位疫苗 2 ～博士学位论文 ～ 博士学位论文 鸡传染性法氏囊病中国超强毒株的培育致弱及亚单位疫苗的研究 Abstract In this rleseB／ch one strain of very vimlent infectious bursal disease vims(wIBDV) wiⅡ1 hi曲pathogenicity was isolated and idenfified from south of(：hil】a．One attenuated sITaJn with high immunity and CEF adaptation was also obtained from this wIBDV through culturing and r