生物化学- 核酸化学内容资料.pptVIP

核酸的两性解离 DNA和RNA都为两性电解质，具有等电点。 核酸在pH4时，带负电荷 等电点（pI）： pI＝ pKa1＋pKa2 2 DNA的相对分子质量较大，一般为106～109 bp，大多数DNA为线性分子，分子极不对称，虽然其长度可达厘米级但分子的直径只有纳米级。 RNA的相对分子质量较小，通常为104～106 bp。 1．相对分子质量 DNA能被乙醇和异戊醇沉淀。 DNA分子的粘度比RNA分子的粘度要大得多 。 不同相对分子质量的核酸沉降速度不同。一般情况下，超螺旋DNA 环状DNA 线形DNA。 2．粘度与沉降特性 嘌呤碱与嘧啶碱有共轭双键，使碱基核苷、核苷酸和核酸在240～290nm紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。 3．紫外吸收 4．变性与复性（变性） 定义：指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉及共价键（磷酸二酯键）的断裂。 变性因素：热变性、酸碱变性和化学变性等。 定义：变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。 高温变性 缓慢冷却 热复性 退火 4．变性与复性（复性） DNA复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得到部分恢复。但将热变性的DNA骤然冷却，不能复性，只有缓慢冷却时才可以复性。 高温变性 缓慢冷却 热复性 急速冷却 复性失败 4．变性与复性（复性） 4．变性与复性（复性） 影响核酸复性速度的因素很多： ①核酸浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。 ②核酸分子越大，链间错配频率越高，复性速度越慢。 ③核酸链内重复序列多，易形成互补配对，复性速度较快。 ④维持一定的溶液离子强度，消弱磷酸基静电斥力，可加快复性速度。 ⑤选择最佳的复性温度，温度太高会使核酸发生变性，而温度过低会使错配的两链无法分开。 通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称该DNA的溶点或溶解温度，用Tm表示，DNA的Tm值一般在70～850C之间。 变性的相对量 温度0C 60 80 100 1.0 1.2 1.4 1.6 0 Tm Tm Tm 100% Poly d(A-T) Poly d(G-C) DNA 5．熔解温度 Tm值的大小与下列因素有关： （1）DNA的均一性 （2）G-C含量 （3）介质中的离子强度 5．熔解温度 （1）DNA的均一性：一般均一性越高，Tm值的变动范围越小。 （2）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越大，Tm与G-C含量成正比关系。因为G-C比A-T更稳定（氢键）。Tm与所含G-C的多少的关系，可用经验公式计算不同DNA的Tm： （G＋C）％＝(Tm－69.3)×2.44 5．熔解温度 （3）介质中的离子强度：一般离子强度较低，DNA的Tm值也较低，范围也越窄。 温度0C 70 80 100 1.2 1.4 1.5 90 1.1 1.3 A 260 0.01 0.02 0.05 0.2 0.1 0.5 1.0 大肠杆菌DNA在不同KCl浓度下的Tm 5．熔解温度 6．摩尔磷吸光系数 核酸分子中磷原子的含量基本稳定。 根据磷的含量测定核酸溶液的吸光度，以每升核酸溶液中一摩尔磷为标准来计算核酸的吸光系数，就叫做摩尔磷吸光系数，用ε（P）表示。 二、核酸的分离 核酸的分离原则： 尽量简化操作，缩短提取过程； 减少化学物质对核酸的降解； 减少核酸的生物降解； 减少物理因素对核酸的降解。 二、核酸的分离 核酸的分离方法： 细胞裂解； 酶处理； 核酸的分离提纯： 盐提取法 酚提取法 层析法。 三、核酸的分析 纯DNA的OD260/280≥1.8。 纯RNA OD260/280≥2.0，如果样品中含有杂蛋白，比值会明显下降。 如果OD260/230≥1.8时样品是纯的，否则样品中含有杂多糖。通常1.0 OD相当于50μg/mL的双螺旋DNA或 40 μg/mL单链DNA（或RNA）。 紫外法 1977年两位学者分别提出了化学断裂法和双脱氧链终止法。 这两种方法的基本原理相同，都是用不同的专一性手段使被分析的DNA分子断裂成若干带放射性标记的、长短不一的片段，然后用测DNA片段的相对长度来测核苷酸的顺序。 四、核酸测序的研究方法 Sanger双脱氧链终止法 四、核酸测序的研究方法 Gilbert化学断裂法 四、核酸测序的研究方法 DNA片段一端用放射性标记，用碱基特异性的化学反应裂解DNA，通过标定末端与断裂位点之间的距离来确定碱基的位置。 四、核酸测序的研究方法 最新的测序方法： 焦磷酸测序技术： Roche公司的GS FLX系统（454系统）； 桥扩增测序技术： Illumina公司的Genome Analyzer系统（Solexa系统）； 连接测序技术