八环境样品中细菌总数的测定.PPTVIP

实验九 环境样品中细菌总数的测定 ------ 平板菌落计数法 微生物生长量的测定 （一）稀释平板菌落计数法 是一种最常用的活菌计数法。 （二）血球计数板法（P53） 这种方法的特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外测定结果是微生物个体的总数（活菌和死菌） （三）称干重（一般干重为湿重的10-20%） 这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。 （四）比浊法 (浊度计） 一、实验目的 1．学习环境样品（水样、泥样）采取方法和细菌总数的测定方法。 2．了解平板菌落计数的原则 二、基本原理 本实验应用平板菌落计数技术来测定环境样品中的细菌总数。 由于水/泥样中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差异很大，不可能找到一种培养基在同一条件下，使所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中 总细菌总数仅是近似值。目前，一般是采用营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基---淡水、土壤中细菌，2216E---海洋细菌的生长繁殖，出现肉眼可见的菌落来计数。 本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，37℃24-48h培养后所生长的菌落数。 三、材料与器皿 (—) 固体培养基 1、牛肉膏蛋白胨培养基（用于淡水、土壤样） 2．2216E培养基(用于海水、海泥样) （二）材料： 移液器、灭菌水、无菌平皿、盛有4. 5 ml无菌水的试管、试管架和记号笔等。（在空试管中加入无菌水及待测样品混匀） 四、实验操作 1. 水样采集-----湖水和海水 将无菌的带玻塞的小口瓶，瓶口向下浸入距水面10～15cm深的水层中，然后翻转过来，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流人瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。 2.细菌总数的测定 (1)水样吸取及水样稀释 选择平均菌落数在50～200之间稀释度的平板为适宜。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀释倍数，作为该样的细菌总数进行报告。若细菌数多到无法计数时需要继续稀释，使其稀释培养后平板上的菌落数在30-300个之间。 （在本实验中，预先了解环境样品中可能的细菌数量，设计稀释梯度；如未知环境样品，应该做多个试验梯度及3个以上平行梯度） (2)吸取稀释后水样（0.2ml）加入平板 (3)于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的琼脂培养基(15～20mL) (4)置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。 （5）计数 (一)菌落计算原则 对那些看来相似，并且长得相当接近，但并不相触的菌落，只要它们之间的距离至少相当于最小菌落的直径，便应该—一予以计数。 对链状菌落．看来似乎是由于一团细菌在琼脂培养基和水样的混合中被崩解所致，应把这样的一条链当做一个菌落来计数，不可去数链上各个单—的菌链。 若同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半时，而另—半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同一稀释度的平均菌数，供下—步计算时用。 （二）计数方法 培养48h后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算： 　　每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5（每次取样均是0.2ml） （1）计算相同稀释度的平均菌落数 。 同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。如相差较大，表示试验不精确。 （3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两个稀释度菌落总数的比值来决定取数。如比值小于2，应取两者的平均数；如比值大于2，则取其中较小的菌落总数进行报告。 （4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数进行。 （5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。 （6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数进行报告。 计算菌落总数方法举例 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。 （7）菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数报告；大于100时，采用二位有