课件：生化技术课件第二章沉淀.ppt

去污剂 有机溶剂 蛋白水解酶 DNP／RNP复合物的解聚 十二烷基硫酸钠(SDS)或Tween40 …… 乙酸钾溶液 离心除去沉淀物 上清液即为初步纯化的核酸制品 (1)去污剂 苯酚、氯仿 上层水相(含核酸)和下层有机相 界面：变性凝聚蛋白 收集水相 (2)有机溶剂 ①水相和有机相的位置 ②充分接触，速度适当 ③苯酚重新蒸馏 ④异戊醇混合液 注意点 ： 溶菌酶 蛋白酶K 蛋白酶E (需灭活DNase) (3)蛋白水解酶 杂质的消除 (1)多糖 体内的糖原和淀粉自然分解 选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，适用于酸性多糖) (2)DNA与RNA的分离 ①盐析法 DNA和RNA在NaCl溶液中溶解度不同 1-2mol/L; 0.14mol/L ②酶水解法 DNase和RNase 核酸沉淀 (1)有机溶剂 ①乙醇-盐溶液 DNA片段1kb或核酸溶液浓度1μg／ml，置-70℃需数小时到十几小时，高速离心(16000r／min，15min) DNA片段1kb的核酸溶液，置室温下仅需数分钟，高速离心 ②异丙醇 核酸沉淀的形状与其分子质量密切相关 106Da：丝状纤维 106Da：凝胶 (2)聚乙二醇: 阶梯式浓度 1.65kb的DNA，5％PEG 1.2kb的DNA，6％PEG 0.6kb的DNA，7％PEG (3)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 生命科学学院：金晶 Copyright(C) 2009 生命科学学院：金晶 Copyright(C) 2009 可编辑 生命科学学院：金晶 Copyright(C) 2009 可编辑 第二章 生物大分子的纯化方法 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题 达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题 。 概 述 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等） 离心 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析 快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。 常用的分离纯化方法和技术有： 沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 基本原理：溶解度的不同 不同溶解度的产生的原因：亲和力的差异 溶解度的大小与下列因素有关： 溶质和溶剂的化学性质及结构 加入某些沉淀剂 溶液的pH值、离子强度和极性 中性盐沉淀法（盐析法） 有机溶剂沉淀法 蛋白质沉淀法 有机聚合物沉淀 选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀） 结晶沉淀法 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。 在蛋白质领域应用最广，其突出的优点： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 中性盐沉淀蛋白质的基本原理 盐分级沉淀：多次盐析的应用 中性盐的选择： 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大： 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水） 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 2) 分离效果好 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用 4) 价格便宜，废液不污染环境 缺点：需要一定时间脱盐 盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法 最常用的是固体硫酸铵加入法 原则：缓慢均匀少量 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录（p24-25）中查出。 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，