分子生物学基本研究法课件.pptVIP

第六章  分子生物学研究法 （下）;本章主要内容;; 步骤： （1）选择特定的限制内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标签。 （2）将这些标签连接在一起、克隆和测序。 （3）根据其占总标签的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。（图P194） AE？TE？双标签？如何分离3’端酶切片段？;;2. RNA选择性剪接;类型;3、原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）;; 荧光原位杂交(FISH)： 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 优点：不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。 ; ;;;;1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术;2、重叠延伸技术;3、大引物诱变法;;;;插入基因包括正向选择标记基因和负向选择???记基因。 正向选择标记基因neor(新霉素抗性基因)通常被插入到靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重组置换靶基因最重要的功能域，以使靶基因彻底失活。 利用筛选培养基检测是否存在正向选择标记基因，可以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中。 ;负向选择标记基因HSV-tk(疱疹病毒胸苷激酶基因)： 如打靶载体是随机整合到细胞基因组上时，HSV-tk基因也被整合到基因组上，故细胞就不能在含有负筛选药物(丙氧鸟苷)的培养基中存活。 疱疹病毒胸苷激酶蛋白可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性的核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。 如打靶载体是通过同源重组整合到靶位点上， HSV-tk不能被整合到基因组中，细胞得以在含有正负筛选药物的培养基中存活下来。（图见P203）;;基本原理:;真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重 组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干 细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载 体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。;方法;显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 ;(2)条件型基因敲除; ;构建打靶载体;需消除靶基因活性时： 通过与带有重组酶基因ES细胞杂交，可以把两个LoxP位点中间的DNA片段切除，使靶基因失活。 将标记基因的两侧也连入LoxP序列可在它影响靶基因转录时，将其删除。 从理论上说，可根据实验需要，设计在不同发育时期、不同空间任意敲除任何一个靶基因。;T-DNA：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。 Ti质粒：是根癌农杆菌染色体外的物质，为双股共价闭合的环状DNA分子。 报告基因：是一种编码可被检测的蛋白或酶的基因，是一个表达产物非常容易被鉴定的基因。;基因敲除的意义： ① 研究基因功能 ② 转基因动物的制备 ③ 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物 ;;;;;Date;酵母双杂交技术的基本原理;;;;;;;;基本原理： ①将特定的顺式作用元件构建到最基本启动子的上游，把报告基因连接到基本启动子下游； ②将GAL4 的DNA结合结构域（BD）置换为其它蛋白（待测转录因子），只要它能与顺式作用元件相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域（AD）激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。 ③可通过报告基因的表达将编码待测转录因子的基因筛选出来. 图P206 6-15 ;基本操作过程为:;;4.免疫共沉淀技术;靶蛋白抗体; 是利用双链小片段RNA(siRNA)高效、特异性降解细胞内源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。;1998年，首次发现双链RNA被摄入细胞后，可高效特异性抑制同源的靶基因表达。 非哺乳动物细胞：较长的双链RNA可直接产生RNAi作用。 哺乳动物细胞：较长的dsRNA（double-stranded RNA, dsRNA）会导致非特异性基因沉默。只有大约21个核苷酸的siRNA才能有效引发特异性基因沉默。P213 图6-24;RNAi作用机制;RNAi技术的应用：;6.4 基因芯片及数据分析;基因芯片（gene chip） :利用点样机等机械装 置，在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、 成千上万个“点”，每个“点”含有可与一种基 因杂交的一条DNA探针。由于芯片上有序地排列 着DNA探针，因此也被称为微阵列。 ;;原理：在芯片上滴加样品后，在合适的条件下， 样品中含有的各种核酸片段就与相应的探针杂交。 由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的 荧光强度就与样品中所