分子生物学常用技术上课件.ppt

分子生物学常用技术;PCR产物; (1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16℃过夜/22 ℃ 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃;(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、 原位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测： 原核表达：SDS(重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化;(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平 细胞???期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。。。。。。。 (17)作用机制;1. PCR：Pfu, 加A尾；[1208/8:00] 2. Agarose电泳：Goldview染色; [1208] 3. 核酸纯化：凝胶回收Kit; [1208] 4. Agarose电泳：检测回收条带; [1208] 4. 连接反应：pGMT, 22℃ 2h; [1208] 5. 转化：Top10, 热激法，蓝白筛选。 [1208];实验三;实验 XXX 设备：加样器 耗材 试剂和配制方法：详细 步骤：详细;1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS 分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学;; Albrecht Kossel ;Lord (Alexander R.) Todd ;1962年诺贝尔生理或医学奖;;DNA半保留复制;变性与复性;一、核酸的分离、纯化和鉴定 基因组DNA的分离、纯化： PCR、Southern- blot、构建基因组文库 实验材料：哺乳动物组织(50~100mg) 哺乳动物细胞(5x105~107) 六孔板/T25;实验步骤：RT 匀浆：TE pH8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase、37℃/55 ℃ 抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 洗涤：75％乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O; 注意事项： (1) 试剂：pH值准确 (2) 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20℃，避免反复冻融 (3) 抽提：完全，不要触及蛋白层 (4) 干燥：避免过分 (5) 操作：小心，机械剪切作用，80~100kb ;3. 质粒：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行 复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状 的共价闭环双链DNA分子。 ;合格质粒的组成要素;第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记：（1）Ampr ：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr ：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor：氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活。（5）hygr： 使潮霉素β失活。;; 碱裂解法;;4、核酸纯度的鉴定;二、基因的克隆与鉴定方法;基因的化学合成 前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列 适用：分子量较小、价值极高的目的基因 历史：1979年，