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第五章 分子生物学研究法;重组DNA技术;重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。;重组DNA操作一般步骤：;获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。; 细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建;;;重组DNA工具酶; 基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌??载体上，便构成了该生物的基因文库。; 反转录人工合成互补DNA; 聚合酶链式反应（PCR）; 聚合酶链式反应（PCR）; 聚合酶链式反应（PCR）;; PCR技术的发明;基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。; 限制性内切酶; 载体; 以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆;32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法;基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是遗传转化。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。 通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物;DNA操作技术;;;;核酸的分子杂交;核酸分子杂交;细菌转化;转导;转导 transduction;核苷酸序列分析;AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’;反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基. 电泳结构通过显色指示.;四个化学裂解反应产物经凝胶电泳分离后的寡核苷酸阶梯 ;杂交测序;DNA与蛋白质相互作用研究;;放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带;蛋白质与DNA相互作用;32p;基因克隆的主要载体系统;质粒DNA及其分离纯化 ; E．coli的质粒种类 1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）;质粒载体DNA的分离 关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型;氯化铯密度梯度离心法;碱变性法;重要的大肠杆菌质粒载体;2.??ColE1质粒载体;3.? pBR322质粒载体;第一个优点：具有较小的分子量，其长度为4,363bp。由于分子量小，不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起来仍较为便利。 第二个优点：具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择记号。质粒DNA编码的抗生素抗性基因的插入失活效应，是检测重组体质粒的一种十分有用的方法。 第三个优点：具较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增，每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。;4.??pUC质粒载体;??? 第一，更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子缩小了许多，如pUC8为2 750bp，pUC18为2 686bp。同时，由于rop基因缺失，使pUC8质粒的拷贝数比带有pMB1或ColE1复制起点的质粒载体都要高得多，不经氯霉素扩增，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。 ??? 第二，可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可用