甲胎蛋白特异性sirna表达载体的构建及其在胃癌细胞株fu97中沉默效应的鉴定-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

山东大学硕十学位论文甲胎蛋白特异。性siRNA表达载体的构建及其 山东大学硕十学位论文 甲胎蛋白特异。性siRNA表达载体的构建及其 在胃癌细胞株FU97中沉默效应的鉴定 摘要： 目的甲胎蛋白(AFP，alpha-fetoprotein)自被发现以来，作为一个胎 儿异常和肿瘤的标志物，在临床诊断和病情监测等方面发挥了重要作用，其在l临 床中的意义受到人们的充分研究。然而这几十年中，甲胎蛋白的生理学功能及其 在肿瘤发生发展中的生物学作用受到的关注却相对较少，只是在最近十年中人们 才意识到甲胎蛋白在肿瘤生长中的调节作用并开始实验研究。我们以可特异表达 甲胎蛋白的人类胃腺癌细胞株(AFP-producing gastric adenocarcinoma cell line，FU97)为研究目标，利用RNA干涉技术，针对甲胎蛋白基因的不同靶序列， 构建了三个能在哺乳动物细胞中表达小发夹RNA的表达质粒， pSIREN—DNR—DsRed—Express Donor Vector—AFP—siRNAl／2／3(简写为pDonor Vector--AFP-siRNAl／2／3)，分别观察其在FU97中对甲胎蛋白基因的沉默作用， 并研究抑制甲胎蛋白基因后对此肿瘤细胞生长及凋亡的影响，由此我们可以研究 甲胎蛋白在AFP相关肿瘤发生发展中的作用，并探讨其在AFP相关肿瘤的基因治疗 方面潜在的应用价值。 方法首先选择3个符合条件的AFP特异性RNA干涉靶序 列，这三段序列分别为：①cAGGGAGAcA”cATG从c，起始于508位，Gc含量为47％② CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，Gc含量为47％匿)GGCTGACATTATTATCGGA， 起始于1474位，Gc含量为42％；然后分别体外合成两段互补的寡核苷酸，与线性 载体pSIREN—DNR—DsRed—Express Donor Vector连接；确定构建成功后，利用转染 试剂将3个重组质粒(pDonor Vector—AFP-siRNAl／2／3)和对照质粒(包括阳性对照， 阴性对照，空白对照)分别导入FU97中，同时此载体可独立表达DsRed荧光蛋白， 山东大学硕—t学位论文转染后8至12d时在荧光显微镜下可通过直接观察荧光蛋白的表达来计算质粒的 山东大学硕—t学位论文 转染后8至12d时在荧光显微镜下可通过直接观察荧光蛋白的表达来计算质粒的 转染效率，而不影响siRNA沉默的效果；然后在质粒转染入肿瘤细胞48d,时后，用 相对定量RT--PCR法检测AFP基因在mRNA水平的变化，而AFP蛋白水平的表达变化则 通过化学发光免疫分析仪检测培养上清，结合免疫细胞化学法来检测：最后通过 MTT实验及流式细胞术(Annexin V／PI双染色法)，检测抑制AFP基因后对FU97细胞 生长及凋亡的影响。 结果基因测序结果表明插入片段的序列与合成的AFP寡 核苷酸序列完全相符，即成功构建pSIREN-DNR—DsRed—Express Donor Vector AFP—siRNAl／2／3载体；转染后，荧光显微镜下DsRed荧光蛋白表达率达30％，说 明质粒的转染效率可达30％；RT-PCR结果表明在mRNA水平，所构建的三个质粒都 可抑$0AFP基因的表达；培养上清的结果进行统计学分析显示实验组三组(pDonor Vector—AFP—siRNAl／2／3)与空白对照组之间的AFP水平均不同(P0．01)；MTT实 验表明抑制了AFP基因表达后能够明显抑制FU97的生长；用流式细胞术(Annexin V／PI双染色法)检测发现抑制了AFP基因表达后，可诱导肿瘤细胞的凋亡。 结 论首次在特异表达AFP的人胃腺癌细胞株中，利用构建的siRNA表达载体明显干扰 AFP的mRNA及蛋白的表达，同时发现抑$0AFP基因的表达能够直接抑制人胃腺癌细 胞株FU97的生长并诱导其凋亡，为探讨甲胎蛋白在AFP相关肿瘤的基因治疗方面的 应用价值奠定了理论基础。 关键词：甲胎蛋白；RNA干涉；FU97；胃癌：基因沉默 4 山东大学硕士学位论文Construction 山东大学硕士学位论文 Construction of expression vector of siRNA specific for aIpha—fetoprotein and identification of its efficiency in FU97 gastric careinoma ceI I I iRe Abstract： Objective Since alpha-fetoprotein(AFP)was found，as a marker for fetal di sease and some tumor