鸡毒支原体JN株的分离鉴定及PCR检测方法的建立-兽医专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士专业学位论文 山东农业大学硕士专业学位论文 鸡毒支原体 鸡毒支原体 JN 株的分离鉴定及 PCR 检测方法的建立 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 10 鸡毒支原体 JN 株的分离鉴定及 PCR 检测方法的建立 中文摘要 鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum，MG)是鸡的慢性呼吸道病 (Chronic Respiratory Disease，CRD)的病原体，其特征为呼吸啰音、咳嗽、 流浆液性鼻液，气囊炎，严重时张口呼吸。通常与病毒、细菌协同感染， 导致呼吸道症状加剧，使死亡率增高。MG 感染在国内禽群中相当普遍， 感染后鸡死亡率一般很低，主要表现为产蛋率、孵化率降低，出栏期延长 和饲料利用率降低，对该病的预防和控制程序也额外增加了成本，同时造 成禽产品中药物残留，给养禽业造成严重的经济损失。 本研究通过对山东济南某鸡场(舍)的患呼吸道疾病的鸡进行支原体 的分离，通过菌落观察及细菌 L 型恢复试验，分离纯化了一个支原体分离 物。对所分离的支原体分离物进行了菌落形态观察、菌落红细胞吸附试验、 生理生化及血清学鉴定，结果该分离物被鉴定为鸡毒支原体，命名为 JN 株。JN 株在不含葡萄糖的液体培养基中，加入四氮唑能使培养基颜色变 橙红色，在固体培养基表面所形成的菌落呈典型的油煎蛋状外观，大小约 0.1～0.4mm，抗 MG 血清对 JN 株的代谢有抑制作用。 通过 JN 株在不同血清培养基的生长情况，可以看出该菌株易于在猪 血清培养基中生长，可以代替价格较贵且来源有限的马血清。从 MG 对鸡 气管环的致病性试验结果可看出 JN 菌株对气管环纤毛的损伤较大，能够 引起鸡胚气管环纤毛运动快速停止，致病力较 F 疫苗株强。同时， SDS电泳图谱显示 JN 株、F 株之间的蛋白条带有一定差异，可以 说明 JN 株的致病性与结构蛋白之间存在一定的相关性。 针对鸡毒支原体(MG)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae，MS) 和火鸡支原体(Mycoplasma meleagridis，MM)设计了 3 对引物，大小分别 为 MG 732bp，MS 208bp，MM 850bp，通过单一 PCR 反应，分别得到了 相应的目的片段，并且建立的多重 PCR 反应优化后，可同时得到 3 条目 的条带，与单一 PCR 扩增结果一致。实验表明，由此建立的多重 PCR 方 法可用于 MG、MS 和 MM 的同时检测和鉴别诊断，且简便快捷，灵敏度 高，特异性强。 针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、鸡新城疫病毒 (NDV)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)等 4 种主要呼吸道传染病病原设计 了 4 对特异性引物，大小分别为：IBV 1720bp、AIV 550bp、NDV 300bp、 ILTV 647bp，与 MG、MS 建立多重 RT-PCR，反应优化后可同时扩增出了 清晰的目的条带。实验表明，建立的多重 RT-PCR 可用于混合感染上述 6 种呼吸道传染病病原的鉴别诊断。 通过药物浸泡法、温差法和熏蒸法分别处理支原体污染严重的种蛋， 出雏 8 周后对支原体抗体阳性率进行检测，结果为：百毒杀处理组 13%， 红霉素处理组 17%，温差法处理组 9%，熏蒸法处理组 18%，而未经处理 的 MG 阳性种蛋支原体阳性检出率却高达 86.4%，尽管孵化率有不同程度 的下降，但都能够显著降低 MG 的垂直传播。通过对孵化率、MG 抗体检 出率和 35 日龄平均体重、110 日龄平均体重等指标进行综合评估，建议 在生产实践中应用温差处理法可有效地降低 MG 的感染。 总之，本研究对分离株进行了分离鉴定并建立了分子生物学检测方 法，为今后进一步开展基因工程疫苗研制以及鸡毒支原体感染的综合性防 治研究奠定了基础。 关键词：鸡毒支原体；JN 株；分离鉴定；结构蛋白；多重 RT-PCR；建立 The Identification and Establishment of the PCR Assay of Mycoplasma gallisepticum Jinan strain isolate Abstract Mycoplasma gallisepticum (MG) is a primary pathogen causing chronic respiratory disease in chicken, which is characterized by coughing, nasal discharge, rattling and air-saccaulitis. Usually chickens suffered co-infection with virus an