蜜蜂和胡蜂蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5基因的克隆与表达-农业昆虫与害虫防治专业毕业论文.docxVIP

浙江大学博j：学位论文蜜蜂和胡蜂蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5 浙江大学博j：学位论文 蜜蜂和胡蜂蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5 基因的克隆与表达 中文摘 要 蜂毒，包括蜜蜂蜂毒(honeybee venom)和胡蜂蜂毒(vespid venom)，是古今中 外应用广泛的天然药物，具有重要的开发利用价值。蜂毒明肽(apamin)、镇静肽 (secapin)和肥大细胞脱粒肽(MCDP)是蜜蜂蜂毒的3个主要的多肽，在医学、分 子生物学研究等方面均具有重要的研究开发利用价值；蜂毒过敏原抗原5(allergen antigen5，A95)是胡蜂蜂毒的主要过敏原之一，在蜂毒的过敏诊断和治疗上有重要的 应用价值。目前，我国所开展的蜜蜂蜂毒分子生物学研究不多，而胡蜂蜂毒的研究又 几近空白。本论文开展了蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5基因的 克隆与表达研究，首次证明了胡蜂总科存在与蜜蜂相似的明肽、镇静肽、肥大细胞脱 粒肽基因，并同时将它们在大肠杆菌和昆虫细胞中进行了表达；同时，我们还首次克 隆到了额班黄胡蜂过敏原抗原5基因，并将其在原核和真核两个表达系统中进行了高 效表达。本文是国内首次开展的胡蜂蜂毒的分子生物学研究。 主要结果包括下列四个部分： 1．蜂毒明肽基因的克隆与表达 (1)用RT—PCR方法克隆了中华蜜蜂、意大利蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂、额班黄胡 蜂和亚非马蜂蜂毒前明肽原基因的编码区，序列全长均为141 bp，这6种蜂的前明肽 原都是由46个氨基酸残基组成，预测的分子量都为5．1kD。根据氨基酸联配结果，6 种蜂的fji『明肽原可分为两种类型，而6种蜂的明肽是完全保守的。利用3’RACE方法 克隆到了中蜂明肽3’非编码区的162bp序列，与意蜂的相应序列有91．4％的同源性， ￡要的变化是中蜂在226bp处分别有lbp的插入，丽在236和237bp位置则有2bp的 缺失。 (2)将中华蜜蜂前明肽原与3’非编码区部分序列和成熟肽与3’非编码区部分克隆． 分别构建了前明肽原与谷胱甘肽转移酶(GST)和明肽与GST融合表达载体 pGEX／AccPPapamin和pGEX／AccApamin。将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)进 浙江大学博士学位论文行融合表达。两者的表达产物经SDS．PAGE分析，分别在28kD和3lkD处产生特异 浙江大学博士学位论文 行融合表达。两者的表达产物经SDS．PAGE分析，分别在28kD和3lkD处产生特异 性的表达条带，均与预期分子量大小一致；以抗GST抗体的Western印迹分析也证实 了中蜂明肽和前明肽原的表达产物在28kD和3lkD处有很强的交叉反应，表明中蜂明 肽和前明肽原与GST融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达。明肽与GST融合蛋白的表 达产物约占总蛋自的30％，通过表达条件的优化，表达的目的蛋白多为可溶性融合蛋 白。通过GST亲和层折柱回收和凝血酶的切割，得到了中蜂明肽蛋白。 (3)应用Bac．to—Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中快速表达了中蜂明肽与增强型 绿色荧光蛋白(EGFP)基因的约34kD的融合蛋白，表达的特异性蛋白(表达量)占 Tn细胞总蛋白的10．9％。以鼠抗His抗体作Western印迹分析，发现表达产物在约34 kD处有明显的阳性条带，与预期目的蛋白分子量大小一致。 2．蜂毒镇静肽基因的克隆与表达 (1)用RT．PCR方法克隆了中华蜜蜂、意大利蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂、额斑黄胡 蜂和亚非马蜂蜂毒前镇静肽原基因的编码区序列，全长均为234 bp，这6种蜂的前镇 静肽原都是由77个氨基酸残基组成，预测的分子量都为8．5kD。根据氮基酸联配结果， 意蜂杭州种群、墨胸胡蜂、大胡蜂、亚非马蜂、中蜂和额斑黄胡蜂与欧洲意蜂前镇静 肽原同源性分别为9796、96％、93％、93％、85％和85％；亲缘关系不同的6种蜂彼此之间 的同源性都大于85％。从代表成熟肽(镇静肽)的最后25个氮基酸序列看，亲缘关系 不同的6种蜂的镇静肽可以分为三种类型，意蜂(杭州和欧洲种群)、大胡蜂和墨胸胡 蜂为第～种类型，亚非马蜂为第二种类型，中蜂和额斑黄胡蜂为第三种类型。从6种 蜂耵镇静肽原氨基酸序列所作的进化树可见墨胸胡蜂、意蜂(欧洲与杭州种群)、大胡 蜂和哑非马蜂前镇静肽原同处一个分枝中，中蜂与额斑黄胡蜂处在另一个分枝中。中 蜂tj额斑黄胡蜂，墨胸胡蜂与意蜂(欧洲与杭州种群)前镇静肽原的同源性最高。6 种蜂的蜂毒前镇静肽原的亲缘关系与这6种蜂的亲缘关系并不完全一致。 (2)以3’RACE方法，扩增和测定了中蜂镇静肽基因3’端非编码区219bp序列。3’ 端：i}：编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有73．1％同源性。将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟 腻编码I蔓与3’非编码区部