抗肾小球基底膜抗体的中和性单链抗体的筛选、表达、鉴定与应用-内科学(肾病)专业毕业论文.docxVIP

原创本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 原创 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者：肖静f璐 日期：2011年3月19日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学 可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文 或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：肖静1肖静 日期：2011年3月19日 中文摘要中文摘要 中文摘要 中文摘要 目的 抗肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)病指的是循环中 抗GBM抗体在脏器中沉积所引起的一组自身免疫性疾病。其特点是在外周血中可 检测到抗GBM抗体，或肾活检病理在肾小球基底膜上见到抗GBM抗体呈线样的沉 积。抗GBM抗体是公认的致病性抗体，它的靶抗原也称为Goodpasture(GP)抗 原，即基底膜IV型胶原0【3链的非胶原区l[0【3(IV)NCl]。在正常情况下，该抗 原隐蔽在基底膜IV型胶原的非胶原区中。在环境因素或其它因素的作用下，一 旦该抗原决定簇暴露，即可诱发自身免疫反应。抗GBM病大多病情凶险，起病急、 进展快，是预后最差的肾脏病之一。尽管目前临床上采用血浆置换与糖皮质激素 联合环磷酰胺进行治疗，仍有少数患者早期死于肺大出血。尤其是血浆置换疗法 仅能清除循环中游离的抗GBM抗体，而不能彻底清除已经与GBM结合的抗体，不 仅费用昂贵，还有可能增加血液传播疾病的风险。而联合应用大剂量糖皮质激素 和环磷酰胺进行冲击治疗，倒是可以抑制疾病早期免疫炎症反应，但是这种疗法 同时也抑制了全身的免疫防御反应，会加重或诱发感染。因此，如何能够特异性 的抑制抗GBM病的免疫反应将成为富有前景的课题。 噬菌体展示技术是目前一项极其重要的抗体工程技术，它可以直接从抗体库 中筛选出特异性噬菌体抗体，并将抗体片段呈现于噬菌体的表面。噬菌体抗体兼 备了多克隆抗体和单克隆抗体的很多性能，而且可以经过很容易的改建，在大肠 杆菌或酵母菌中进行大规模的生产。因此，噬菌体抗体在疾病的诊断与治疗中表 现出非常巨大的潜能和广阔的应用前景。 本研究即运用新型的噬菌体展示技术，拟从噬菌体抗体库中筛选出抗GBM抗 体的中和性单链抗体基因，然后利用基因工程重组技术，将筛选出来的单链抗体 基因进行克隆及表达载体的构建，最后通过诱导和亲和层析技术获得了纯化的抗 GBM抗体的中和性单链抗体蛋白，并在体内外验证单链抗体蛋白是否可与抗GBM 抗体进行特异性的结合，从而阻滞或减轻抗GBM抗体与靶抗原结合所产生的脏器 损害，希望能为抗GBM病提供更多的治疗手段和实验依据。 方法 1．纯化抗GBM病患者血清中的抗GBM抗体，采用噬菌体表面展示技术，获得 中文摘要一个与人抗GBM抗体结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆，并对该克 中文摘要 一个与人抗GBM抗体结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆，并对该克 隆序列进行DNA序列测定分析。 2．用PcR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因，将scFv3 DNA与pGEM-T Easy 质粒连接，构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切电泳验证重组表达结果正确；测 序检测质粒重组后序列有无改变。再将scFv3亚克隆入表达载体pQE-80L，构建 pQE80L—scFv3重组质粒，转化大肠杆菌Rosetta2菌，通过酶切进行鉴定。IPTG 诱导表达蛋白后，通过SDS—PAGE、Western blot和竞争抑制法对表达产物进行 检测。 3．将Wistar大鼠随机分为五组：(1)肾炎模型组：经尾静脉注入患者抗GBM 抗体(1．5mL／lOOg)。(2)对照I组：经尾静脉注入0．49／L的正常人 IgG(1．5mL／lOOg)。(3)对照II组：经尾静脉注入抗GBM抗体的中和性单克隆抗体 (1．5mL／lOOg)。(4)干预I组：经尾静脉注入人抗GBM抗体(1．5mL／lOOg)，第7 天后再经尾静脉注入抗GBM抗体的中和性单克隆抗体(1．5mL／lOOg)。(5)干预II 组：经尾静脉注入人抗GBM抗体(1．5mL／lOOg