黄芩甙对肝癌细胞体外作用及机制的实验研究-内科学专业毕业论文.docxVIP

中文摘要第一部分黄芩甙对肝癌细胞增殖、凋亡和超微结构的影响 中文摘要 第一部分黄芩甙对肝癌细胞增殖、凋亡和超微结构的影响 目的：观察黄芩甙对肝癌细胞增殖和凋亡的影响，同时观察对肝癌 细胞形态、线粒体等超微结构及线粒体膜电位和细胞内ca”的影响，探讨 黄芩甙抗肿瘤的机制。 方法：应用细胞培养技术培养肝癌细胞BEL一7402，MTT比色法研冬．、 不同浓度、不同作用时间黄芩甙对BEL一7402细胞增殖的影响，光镜、，倒1 置显微镜、荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构的 变化尤其是线粒体的变化，应用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率及线粒体 膜电位、细胞内Ca“的改变，免疫组化法检测细胞bc卜2、bax蛋白表达。 结果：①黄芩甙对细胞增殖的作用：黄芩甙浓度较低时1．25mg几、 2．5 mg几，对肝癌细胞抑制作用不明显；随着浓度增加，抑制作用开始显 现，并渐次增强，5mg几、10mg几、20mg／L、40mg／L时细胞抑制率分别为 24．36％、38．59％、55．87％、75．26％，呈量效关系。10 mg／L黄芩甙作用 于肝癌细胞，24h抑制作用不明显抑制率为8．89％，48h开始抑制作用明 显增加，抑制率为38．59％，随着作用时间的延长，抑制作用愈加显著， 72h、96h、120h抑制率分别为43．27％、54．98％、60．37％，呈时效依赖 关系。 ②黄芩甙对BEL一7402肝癌细胞凋亡的影响：不同浓度黄芩甙1．25mg／L、 2．5mg／L、5mg／L、10mg／L、20mg／L、40mg／L分别作用肝癌细胞48h后， 凋亡百分率分别为2．32％、2．42％、9．86％(pO．01 vs contr01)、17．59％ (p0．01 vs contr01)、22．27％(p0．01 vs contr01)、24．34％(p0．01 vs contr01)，呈量效关系，对照组为2．18％。随黄芩甙作用时间的延长，细 胞凋亡率逐渐升高，24h、48h、72h、96h、120h，分别为5．25％、19．16 ％％、25．87％％、30．24％、33．79％％，呈明显时间依赖关系。 ③黄芩甙对细胞形态及超微结构的影响：用药组细胞变小，变圆，微绒毛 减少，细胞核染色质浓缩、边集，线粒体减少并肿胀。 ④黄芩甙对肝癌细胞线粒体膜电位的影响：对照组在不同时间的线粒体膜 电位较稳定，保持在较高水平， 6h、24h处理组与对照组比差别不大分 别为85．49±2．17、82．59±2．18，48h处理组显著降低至28．45±2．39， pO．01。⑤黄芩甙对肝癌细胞细胞内ca”的影响：对照组在不同时间的Ca” 含量较稳定，6h、24h处理组与对照组比差别不大分别为19．56±2．09、 中文摘要14．76±1．03，48h对照组升高显著88．79±4．32，两组差别显著，p0．01。 中文摘要 14．76±1．03，48h对照组升高显著88．79±4．32，两组差别显著，p0．01。 ⑥Bc卜2、Bax蛋白表达bax、bc卜2阳性反应物呈棕黄色，主要位于胞 浆中，呈细颗粒状均匀分布，黄芩甙处理组bax表达增加，颜色加深，广 泛分布与胞核和胞浆中，而这种转位表达于核内的异位表达现象仅见于那 些出现显著染色体和胞浆浓缩的细胞即凋亡细胞．bc卜2表达减少，颜色 变淡。配合真彩色图像分析，对照和5mg／L、10mg／L实验细胞bax、bcl一2 的10D／cell值分别为113．5、183．7、281．1；261．9、189．4、78．23，各 A Y 组差别显著。 结论：黄芩甙抑制肝癌细胞增殖并诱导肝癌细胞凋亡呈剂量、时间 依赖关系，细胞形态、超微结构出现明显改变，向正常肝细胞方向逆转。 线粒体损伤在黄芩甙诱导肝癌细胞凋亡中起重要作用，其机制可能为抑制 肝癌细胞Bc卜2蛋白表达，促进Bax蛋白表达及细胞内Ca2+增加，激发线 粒体膜通透性转运孔开放，线粒体跨膜电位降低，使肝癌细胞凋亡。 第二部分：黄芩甙对肝癌细胞耐药的逆转作用及机制 目的：研究黄芩甙是否对耐药肝癌细胞具有逆转作用并探讨可能的 作用机制。 方法：MTT法测定细胞的药敏性，流式细胞术测定细胞内罗丹明123 荧光强度、细胞凋亡率及bc卜2蛋白表达，RT—PCR检测MDR。基因表达， Western—blot检钡0 p—gp表文墨。 结果：①肝癌细胞耐药性测定：5一Fu对耐药及敏感肝癌细胞的半数 抑制浓度(IC。。)分别为7020mg／L(BEL一7402／5一Fu)和46．2 mg／L (BEL一7402)，耐药倍数为152．6倍。②黄芩甙的逆转耐药作用及协同作 用：5一Fu单独应用，耐药细胞的IC。。为7020mg／L；与5mg／L黄芩甙共同 作用，耐药细