马铃薯晚疫病菌miRNA分析及Dicer基因功能研究-微生物学专业毕业论文.docxVIP

目 目 录 摘要 l ABSTRACT ．： ～3 一、前言 6 (一)马铃薯生产和晚疫病 6 1．我国马铃薯生产现状 ．6 2．马铃薯晚疫病 ．．6 2．1马铃薯晚疫病的起源、流行及危害 一6 2．2 P卿协幻刀s群体结构 7 3．马铃薯晚疫病防治 ．7 3．1马铃薯抗病育种研究 7 3．2化学防治 ．．8 3．3生物防治 ．8 4．P切钿细刀5的侵染循环 9 (二)马铃薯晚疫病菌 ．12 1．P剃醯幻脚分类地位 ．12 2．户啦斥络幻淞形态结构 ．12 3．卵菌与真菌的区别 14 4．P删砖幻甩s生理特征 ．15 5．P办舾细刀s生殖方式 ．16 (三)P删西枷坫的基因组测序 ．17 (四)非编码RNA的调控作用 18 (五)研究内容和意义 22 二、实验材料和方法 ．23 (一)样品的采集 23 (二)P叫缸幻订s分离及保存 ．25 1．组织分离 ： 25 2．单孢分离 25 3．菌种保存 25 (三)P打舾fcI刀s最适生长条件测定 ．26 (四)不同发育阶段菌体的培养 ．27 (五)尸f，!，盔细甩s致病力测定 (五)尸f，!，盔细甩s致病力测定 ．28 1．马铃薯植株准备 28 2．播种及接种 28 3．统计马铃薯植株叶片发病指数 29 (人)P幻钰触埘小RNA深度测序 31 1．样品收集 31 2．RNA提取及浓度检测 ．32 3．小RNA测序流程 32 (七)利用体外siRNA饲喂沉默DC￡，和DCZ2 ．36 (八)stem—loop Q—PcR实验 ．．． 37 三、实验结果 ．39 (一)P f，{，钰纪刀s不同生长阶段菌体的收集以及l蝌A的分离 39 (二)小F斟A测序结果 。4l 1．序列文库制备和数据分析 4l 2．小RNA在户切铅纪行s染色体上的分布情况 。45 3．预测已知保守的miRNA和新的111iRNA 48 4．rnjRNA和相应靶基因功能的识别 53 5．调节ABC转运蛋白基因的IniRNA 55 (三)孢子囊芽管的萌发和生长需要Dicerl(DCLl)的功能 58 四、讨论 ．62 参考文献 65 附录l培养基配方 ．73 附录2甲醛变性胶配方 ．76 附录3小RNA测序相关试剂，仪器 ．．77 附录4文中涉及的IlliRNA序列信息 79 马铃薯晚疫病菌m 马铃薯晚疫病菌m i RNA分析及D i cer基因功能研究 摘要 晚疫病是全球范围内普遍发生的马铃薯病害，发病迅速且造成巨大的经济 损失。马铃薯晚疫病菌(脚f印Jlz砌D川切铅勉邶)侵染马铃薯的叶片，茎以及块 茎，造成植株死亡，块茎腐烂。已报道户咖钮砌咒s菌株T30-4全基因组大小约 240m，含有大量转座子和反转录转座子，且变异快。本研究选取两个不同致病 力的P f咖砌珊菌株YN-YJ54．1和IIA一4，利用11lulllina测序技术对P f咖纪，2s 三个(菌丝，萌发的孢子囊，孢子囊)阶段的小RNA进行基因组水平深度测序， 分析了P f，z细纪埘miRNA的信息，靶基因功能及与Dicer基因的关系的研究。 结果显示，菌株YN．YJ54．1的菌丝含有33 1个新IniRNA，对应的靶基因1449 个，保守rnjRNA 1805个，对应的靶基因15300个；萌发的孢子囊含有29个新 lniRNA，对应的靶基因71个，保守miRNA 1527个，对应的靶基因10892个； 未萌发的孢子囊含有275个新miI斟A，对应的靶基因180个，保守miIⅢA 1852 个，对应的靶基因1 6540个；菌株IIA．4萌发的孢子囊含有4个新miRNA，对 应的靶基因9个，保守lniRNA 1 046个，对应的靶基因9328个。受miRNA潜 在调控的靶基因占全部基因的80％，具有广泛的功能。在尸咖协纪，ls中，85％ 左右的miRNA与线虫，拟南芥，果蝇，动物等物种里面的耐IⅢA序列同源， 说明最原始的miRNA在尸删钿纪，zs中被大量地保存下来。植物和动物的miRNA 完全不同，在进化过程中，miIⅢA被选择性的保留在植物和动物之中。户啦胚细，ls 中广泛存在的保守mil州A为这一调节分子的进化提供了崭新的证据。 P切舾纪脚有两个编码Dicer蛋白的基因DCZ，和DC阴。体外siRNA饲喂 试验沉默DC￡，基因，菌株表现萌发率下降，同时芽管变短；同时沉默两个Dicer 试验沉默DC￡，基因，菌株表现萌发率下降，同时芽管变短；同时沉默两个Dicer 基因，也观察到类似性状。这种突变体性状并没有因为增加另一个Dicer蛋白基 因的siRNA而变得严重，说明DCZJ对于尸觑细纪，zs孢子囊的萌发和芽管伸长 起关键作用。在动植物中，负责IniRNA产生的Dicer一旦功能受损，都会产生 明显的表型变化。尸咖红