第四章 电泳技术.pptVIP

仪器分析 第四章 电泳技术 电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。 例如蛋白质具有两性电离性质，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，反之则带正电荷，向负极移动。当蛋白质溶液pH值与蛋白质的等电点相等，静电荷为零时则不移动。 第一节 基本原理 在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响： ①颗粒的性质，如：实际电荷，大小及形状，离解强度的难易等。 ②所处的环境，如：电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。 ③应用电场的性质，如：电场强度 不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。其数学表达式如下： μ=v/E=(d/t)/(U/I)=dI/Ut 式中:μ是迁移率，v是颗粒迁移速度(cm／s或cm/min)，E是电场强度或电势梯度(V／cm),d是颗粒移动距离(cm)，I是支持物的有效长度(cm)，U是支持物两端实际电压(V)，t是通电时间。 一、带电颗粒的性质 1、电荷的来源： 胶体颗粒表面的电荷来源是： ①吸附液体中的某离子，因而带电，液体失去该离子而带相反的电荷。 ②作为胶体组成成分的相反符号的离子不等量的进入溶液而带电。 ③固体表面吸附液体分子，然后这些分子解离，因而带电。 2、电泳迁移率公式： 物质在电场中所受到的力(F)为： F=EQ (1) 式中E是电场强度，即单位长度支持物的电位降；Q是物质颗粒的净电荷。 根据史氏定律(Stokes law)，球形分子在液体中泳动所受到的阻力(磨擦力)F`为： F`=6πrηυ (2) 式中r是分子半径，η是介质粘度，υ是分子泳动速度，6π是常数。 当物质在电场中受到的力与物质在液体中受到阻力平衡时，F=F’ υ=EQ/6πrη (3) 已知迁移率(μ)为： μ=v/E μ=Q/6πrη 二、电场强度 电场强度也称电位梯度，是指单位长度(每1 cm)支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。 三、溶液的pH 溶液的pH决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。 四、溶液的离子强度 在保持足够缓冲能力前提下，离子强度要求最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快；通常缓冲液离子强度选择在0.05～0.1 mol／L之间。在缓冲液中离子强度可用下式计算： I=0.5∑cZ2 I=溶液的离子强度，c=离子的浓度，Z=离子的价数。 五、电渗作用 在有支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中，液体对固体支持物的相对移动。 综上所述，可知影响电泳迁移率的因子很多，可以分为以下三大类： (a)与泳动离子(或粒子)本身的特性有关的因子，如电荷符号和大小、本身的大小和形状、水化程度、解离趋势、两性性质等。 (b)环境因素，如缓冲液浓度、离子强度、介电性质、化学性质、pH、温度、粘度、有无极性分子存在(因为它可以影响粘度或介电性)等。在有支持物的情况下，影响因素更多，如支持物的吸附作用，不均一性、离子交换能力、电渗现象、虹吸作用、热和蒸发作用等。 (c)所加电场的特性，如强度和纯度(是否杂有交流电)。这些因素在实验过程中要充分注意，尽量保持条件恒定不变，以便获得可重复的结果。 六、电泳的分类 （一）按分离的原理区分： 电泳按分离的原理可分为4种，即 区带电泳(zone EP，ZEP)、 移界电泳(moving boundary EP，MBEP)、 等速电泳(isotachophoresis，ITP) 等电聚焦(isoelectric cusing，IEF)。 1、区带电泳 不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可以用染色等方法显示出来，如果用光密度计扫描可得出—个个互相分离的峰。（电泳分离原理图） 2、移界电泳 它只能起到部分分离的作用，如将浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形。 3、等速电泳 在电泳达成平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。按浓度对距离作图也是台阶状，但不同于上述移界电泳，它的区带没有重叠，而是分别保持。 4、等电聚焦 由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度。被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带，分辨率很高。 （二）按有无固体支持物区分 根据电泳是在溶液中进行还是在固体支持物上进行，又可以分为自由电泳和支持物电泳两大类。 自由电泳又可分为： ①显微镜电泳(也称细胞电泳) ； ②移界电泳； ③柱电泳； ④自由流动幕电泳； ⑤等速电泳； 总之，各种电泳技术具有以下