CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入.ppt

大全：基因敲除、点突变、基因插入 ;系统简介 系统的应用技术 系统的应用前景; 系统的研究历史 年，日本课题组在 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中， 年，正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 年发现 的间隔序列()与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测细菌可能通过 系统可能以类似于真核生物的 方式抵抗外源遗传物质的入侵。 年， 等首次发现细菌可能利用 系统抵抗噬菌体入侵； 年， 等发现细菌 系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了 系统的功能 年初， 的研究组首次利用 系统对人 细胞 和 基因以及小鼠 细胞 基因实现了定点突变。同年 利用 在人 细胞和 细胞基因的靶位点形成双链或单链的切口，从而激活细胞的 修复机制高效介导外源基因定点插入。; 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列( ) 与长度相似的间区序列( ) 间隔排列而成的 簇，前导序列( ) 以及一系列 相关蛋白基因。 ; 的高度可变的间隔区的获得 首先识别入侵的核酸和扫描外源 潜在的 （序列），将临近 的序列作为候选；然后在 基因座的端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间; 基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工) 当该噬菌体再次入侵细菌时， 簇首先转录为长的前体，然后逐步被加工成小的成熟的。 系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的干扰 结合相关的 蛋白后，形成 蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标相结合，随后 蛋白对目标 进行断裂和降解。;;、系统的应用; 技术是一种由指导蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 等人 利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的 相关蛋白，在一段人为重组的( ) 的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程 进行 改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。;例子：基因敲除的实验过程;在的Ⅱ型系统中将中的切割域突变，会使蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ 结合的能力。这种失去Ｄ??Ａ切割活性的蛋白被命名为 Ｃ。将ｄ与在细胞中共表达，则可以介导ｄ蛋白与ＤＮＡ 结合。如果ｄ结合到靶基因的阅读框内，可阻断聚合酶的延伸作用；如果ｄ结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始; ／系统用于转录抑制需要（３）和至少的－ＤＮＡ配对 利用ＲＮＡ介导能够精确识别靶基因的特点，将ｄ蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的－系统。 真核细胞的转录激活因子可通过将ｄ与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ结合获得。;、技术的优势与前景;目前应用系统的研究主要集中在基因编辑方面。而真正的优势主要在于它具有能够将３种主要生物聚合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质）结合在一起的特殊能力。 各种功能性蛋白都可以通过与蛋白融合，然后利用的靶向作用结合到ＤＮＡ的任意位点，发挥人们预期的功能。 例如：如果与甲基化酶或去甲基化酶、乙酰化酶或去乙酰化酶、激酶、磷酸化酶等促进染色质结构变异的蛋白成功融合还将有助于表观遗传学的研究，并能够持久改变基因的表达状态。如果几个作用于基因组不同位点复合物的协同作用，还可通过改变基因组的结构实现基因调控的目的。;