慢性粒细胞白血病K562细胞适配子的筛选、鉴定与结构分析-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

兰州大学硕士学位论文慢性粒细胞白血病K562细胞适配子 兰州大学硕士学位论文 慢性粒细胞白血病K562细胞适配子 的筛选、鉴定与结构分析 摘要 目的： 利用SELEX技术筛选、鉴定出慢性粒细胞白血病K562细胞的寡核苷酸适 配子，测定出ssDNA文库与K562细胞的结合率，并对克隆适配子进行一级结 构同源性分析和二级结构预测，为白血病的基因诊断和靶向基因治疗奠定实验基 础。 方法： 体外合成长度为88个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库，采用生物素-链 霉亲和素磁珠法制备次级文库，以正常人血液中提取的中性粒细胞为反筛细胞， 利用SELEX技术筛选出与慢性粒细胞白血病K562细胞特异结合的适配子。将 筛选得到的适配子回收纯化后连接pGEM-T质粒载体，经蓝白筛选后，随机挑 选24个克隆子进行序列测定。采用荧光标记引物法检测ssDNA文库与K562细 胞的亲和力，并用DNAMAN软件对适配子序列进行一级结构同源性分析和二级 结构预测。 结果： SELEX筛选产物PCR扩增时最佳退火温度为45℃；每轮筛选的模板含量 和循环次数都各不相同；琼脂糖凝胶电泳结果显示，电泳条带随SELEX轮数的 增加逐渐变细变致密。经过13轮筛选，慢性粒细胞自血病K562细胞适配子的 结合率不断增高，适配子的吸光度彳值从0．12上升到1．25，至第13轮月值无明 显增高。测序结果显示，绝大部分适配子与预期片段长度相同，但有几个适配子 短于预期片段长度。一级结构分析发现无同源序列，但可分为6个家族(family)， 其中5个家族各自具有保守序列，家族6无保守序列。二级结构分析表明：适配 子形成的茎环、凸环结构可能是与K562细胞特异性结合的结构基础。24个克隆 适配子中，第10号适配子与慢性粒细胞白血病K562细胞的结合率最高，为 45．2％，而与正常人血液中提取的中性粒细胞的结合率仅为2．8％。 兰州大学硕士学位论文结论： 兰州大学硕士学位论文 结论： 1、利用SELEX技术从体外构建的88 nt的ssDNA文库中成功筛选出高亲和 力、高特异性的慢性粒细胞白血病K562细胞适配子； 2、成功测出ssDNA文库与慢性粒细胞白血病K562细胞的结合率； 3、成功将第13轮筛选得到的适配子群进行克隆、测序； 4、成功测出克隆适配子与慢性粒细胞白血病K562细胞的结合率； 5、推测适配子形成的茎环、凸环结构可能是与慢性粒细胞白血病K562细 胞特异性结合的结构基础。 关键词： 白血病，粒细胞，慢性；K562细胞；SELEX；适配子 Ⅱ 兰州大学硕士学位论文 兰州大学硕士学位论文 Screening、’CIIaracterization andan structurestru analysis 01“ ● aptamers bindinR to cllronic myelognous leukemia K562 cells ABSTRACT AIM： To screen and characterize oligonuclcotide aptamers of chromc myelognous leukemia K562 cells by SELEX method．To detect the affinities of the screened aptamers binding to K562 cells，to get homology analysis of the primary structure and secondary structure prediction to the screened aptamters，and to lay the theoretical foundation for tumor gene diagnosis and gene therapy． METHODS： The oligonucleotide aptamers specific binding to chronic myelognous leukemia K562 cells are screened from 88 nt random ssDNA library in vitro synthesis by SELEX method，and preparation of sub—library by biotin-streptavidin magnetic，and using neutrophils from blood of normal humen as an anti·sieve cells．The screened aptamters are purified and connected to pGEM—T plasmid vector，and 24 c