微生物学实验教程.docVIP

微生物学实验内容 ??实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色 ??实验二 . 细菌的革兰氏染色 ??实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 ??实验四 . 酵母菌的数量测定 ??实验五 . 酵母菌的大小测定 ??实验六 . 微生物菌落的观察实验 ??实验七 . 霉菌的形态观察 ??实验八 . 培养基的制备与灭菌 ??实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察 ??实验十 . 微生物的纯种分离培养 ??实验一 . 普通光学显微镜的使用 ??一、目的要求 ????1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 ????2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 ??二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理 ????现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因： ????1. 增加照明亮度 ????油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。 ????2. 增加显微镜的分辨率 ????显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。 ????光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α ????式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到 120度，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长 0.55μm来计算，数值孔径通常在 0.65 左右的高倍镜只能分辨出距离不小于 0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2μm左右。 ??三、器材 ????1. 菌种：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）染色玻片标本。青霉（Penicillium sp. ）的水封片。 ????2. 溶液或试剂：香柏油、乙醇：乙醚混合液 ????3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 ??四 . 操作步骤 ????1. 观察前的准备 ???（ 1 ） 显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3～4cm 。镜检时姿势要端正。 ????取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。 ???（ 2 ） 光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 ???（ 3 ） 根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。 ???（ 4 ） 聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。 ????在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调