抗痘苗病毒基因工程抗体的研究-基础兽医学专业毕业论文.docxVIP

沈阳农业丈学硕上学位论文摘要 沈阳农业丈学硕上学位论文 摘要 痘苗病毒(VACV)属于痘病毒科、正痘病毒属，是迄今所知结构最为 复杂的一类病毒，曾是预防天花病毒的一种有效疫苗。1980年世界卫生大 会正式宣布天花被完全消灭，天花病毒在自然界已不存在，并推荐不需再接 种痘苗。然而非法保存的天花病毒有可能成为生物武器而用于生物恐怖，停 止种痘使得多数人暴露于感染天花的危险之中。另外其他痘病毒活动频繁， 1997年非洲猴痘爆发；2003年美国又遭遇猴痘侵袭。为了预防和治疗天花 及其它痘病毒感染、应付突发事件，上述这些重新唤起了人们对痘苗病毒作 为一种疫苗及其相关诊断、治疗性制剂的研究开发兴趣。中和性抗体在抗感 染治疗及紧急被动免疫预防方面一直扮演着重要的角色。由此可见，研制特 异性针对痘苗病毒的中和性抗体以用于紧急预防和治疗是十分必要和可行 的。 基于上述这些我们迸行了以下工作： 首先，我们进行了抗VACV Fab噬菌体抗体库的构建。我们先采集具有 高滴度VACV抗体的免疫鼠脾，分离淋巴细胞，然后进行总I州A的提取以 及cDNA的合成，接着用一系列特异性的PCR引物通过PCR扩增特异性轻 链基因和重链Fd段基因，在对PCR产物鉴定和纯化后，用轻链混合物与噬 菌粒pComb3构建轻链库，随后随机挑选克隆进行轻链插入率鉴定，在确保 轻链库的质量后，将重链混合物克隆入轻链库中构建Fab噬菌体抗体库，同 样随机挑选克隆进行重链插入率鉴定。最后使用辅助噬菌体对Fab噬菌体抗 体库进行包装，检测库容量，结果表明我们所构建的Fab噬菌体抗体库的容 量为2x107，轻链插入率和重链插入率分别为100％和90％，足以满足我们筛 库的需要。 在成功构建Fab噬菌体抗体库的基础上，我们用纯化的VACV病毒对 Fab噬菌体抗体库进行富集，目的是扩大筛选范围，有效地筛选出特异性抗 VACV Fab抗体。随机挑选50个3次富集筛选后的单菌落对其进行了诱导表 摘要 摘要 达，并通过ELISA进行筛选，共获得10株阳性克隆，这10株克隆均有较高 的Fab表达。其中3株与纯化VACV有特异性的结合，其生物学功能还需进 一步研究鉴定。 本文进行了鼠源抗VACV Fab噬菌体抗体库的构建及抗体库的初步筛 选，为下一步Fab抗体生物学功能鉴定及全抗体的制备奠定了基础。 关键词：痘苗病毒(VACV)基因工程抗体 噬菌体展示技术Fab 沈阳农业大学硕上学位论文刖 沈阳农业大学硕上学位论文 刖 吾 痘苗病毒(VAcV)属于痘病毒科、正痘病毒属，是迄今所知结构最为 复杂的一类病毒。痘苗病毒与人类的历史渊源深厚，曾是预防天花病毒的一 种有效疫苗，人们用十年的时间在全球范围内接种痘苗。1977年，最后一 例自然疫源性天花发生在索马里。1978年英国实验室发生事故，有两名工 作人员染上天花——这是天花退出地球舞台之前的最后插曲。1980年世 界卫生大会正式宣布天花被完全消灭，天花病毒在自然界已不存在，并推荐 不需再接种痘苗(Fenner et a1．，1988)。此后痘苗病毒所拥有的独特生物学特性 使其成为表达外源基因的优良载体并用于构建重组痘苗病毒基因工程单价、 多价疫苗来预防感染性疾病(Piccini A．et a1．。1988；Moss B。et a1．，1991；Tartaglia J．，et a1．，1990；侯云德，1990)。 在成功控制并消灭天花流行前，天花病毒是许多国家科研机构的研究对 象，虽然人类消灭了自然疫源的天花病毒，但实验室保存的天花病毒毒种对 人类仍具有许多潜在的威胁，1978年英国发生了天花病毒的实验室感染。 世界卫生组织(WHO)决定减少全球保存天花病毒毒种的实验室数量，1978 年在与各国家总数达823个微生物研究机构协商的基础上，有76个实验机 构通过了资格鉴定(FennerF et a1．，1988；Breman JG et a1．，1980)。而到1984 年只有位于亚特兰大的美国疾病控制与预防中心和前苏联的病原微生物预 防研究所两家研究机构仍存有天花样品。然而，由于上述关于天花病毒在各 国存在和流行的复杂背景，以及天花病毒非常稳定易于在．20℃保存，使得 各国秘密保存天花病毒毒种成为可能。非法保存的天花病毒有可能成为生物 武器而用于生物恐怖，2000年4月21日美国将可能用于生物恐怖主义的病 原菌根据对社会的危害程度分为A、B、C三类，其中天花病毒、炭疽杆菌、 鼠疫杆菌和肉毒杆菌毒素等由于易传播或可在人与人之间进行传播，并可引 起很高的死亡率而被列在危害性最大的A类瘸原菌(Henderson D A。，1999；O‘ Toole T．，1999)；而实验室保存的毒种一旦泄漏也会发生天花的流行，1979 年前苏联斯维尔德洛