枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因在大肠杆菌中的表达及玉米表达载体的构建-微生物学专业毕业论文.docxVIP

摘要本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus 摘要 本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus s“6打Z妇)wHNB02中性植酸酶phyC基因为目的基因 (GenBankAccessionNo．AY220075)，在成熟肽序列之前设计上游引物，在终止密码子 处设计下游引物(引入BamHI／SalI)。用含高保真度的聚合酶TaqPlus进行扩增，得到了 大小约1．1kb的单一条带产物，获得phyC基因表达片段，将该产物与pUCl8-T载体进行 连接，酶切鉴定后，经BamHI和SalI酶切回收处理phyC片段，连接到大肠杆菌表达载 体pGEX一4T-1，转化大肠杆菌JMl09，在含100I．tg／ml的Amp抗性的LB平板上筛选后， 经菌落PCR及酶切鉴定，获得阳性克隆菌株。用终浓度为O．1mM IPTG在含100I_tg／ml 的Amp抗性的LB中诱导表达，酶活测定结果表明，表达产物具有植酸酶活性。 SDS—PAGE电泳结果显示出明显的特异性表达条带，相对分子量(Mn为69kD，30℃诱 导3h后，表达的目的蛋白量占菌体总蛋白的47．4％。 在成熟肽序列之前设计上游引物，在终止密码子处设计下游引物f引入 BamHI／SacI)。用含高保真度的聚合酶TaqPlus进行扩增，得到了phyC基因表达片段，将 该产物与pUCm．T载体进行连接，酶切鉴定后，将该产物经BamHI和SacI酶切处理后 连接到含有胚乳特异性启动子(EGH5promoter)的中间载体pBPC47的多克隆位点上， 转化大肠杆菌JMl09菌株，在含100斗g／ml的Amp抗性的LB平板上筛选到了的阳性菌 落。质粒酶切分析和菌落PCR分析结果表明获得了pBPC-p砂C重组质粒：在分析了 pBPC47载体的基础上，选用了三酶切，先用BgllI和HindIIl双酶切中间重组载体 pBPC-phyC,再用Xhol单酶切，回收了三酶切片段，把启动子_p砂c-终止子 (EGH5-phyC-NOS)片段插入到经HindlII、BamHI双酶切的表达载体pCAMBIAl300的 多克隆位点，转化大肠杆菌JMl09后，经60pg／ml Kana抗性筛选、菌落PCR、质粒酶 切鉴定后，筛选到了阳性转化菌落，质粒酶切分析结果表明获得了pB．C-phyC重组表达 载体，并用基因枪法成功转化玉米愈伤组织。 本研究为中性植酸酶基因在微生物及植物中的高效表达奠定了良好的基础，具有重 要的学术价值和应用前景。 关键词：枯草芽孢杆菌WHNB02 中性植酸酶植酸酶肋粥基因pGEX一4T一1 大肠杆菌表达pBPC47 pCAflBIAl300玉米表达载体 本研究获国家“十五”重点科技攻关子课题(2002BA514A-12)及教育部重点项目(03106)资助。 l 前言1．概述 前言 1．概述 磷是动物必需的一种矿物元素，在体内发挥着重要作用。如果饲料中缺乏磷，会导 致畜禽生长发育迟缓、骨骼和牙齿的发育不良、动物生产性能降低等不良后果。多数植 物性饲料中60～80％的磷以植酸磷的形式存在【1]。猪和禽等单胃动由于体内很少有分解 植酸磷的酶，大量的植酸磷不能被利用而从粪便中排出。美国肯塔基大学经过10年研 究证实，猪只能利用玉米中磷的10．20％、豆饼中磷的25．35％，其它的磷则随粪便排泄 到环境中‘2，31。因此，一方面为满足猪禽生长对磷的需要，必须在饲料中添加价格昂贵的 无机磷酸盐，饲料成本提高；另一方面，粪便中排出的磷又造成对土壤和水源的污染。 据报道，目前世界上每年至少有100万吨磷随废水排放出来，其中30％以上是养猪业所 为∞】。排放到土壤中的磷，不仅不能在土壤中渗透和扩散，还能与铜、铝、钙等元素形 成不溶性复合物保留在土壤中。一些植物如花生，由于土壤中磷的含量超过正常值，导 致卷叶、枯死。一些国家和地区从环保的角度对集约化畜牧场提出了磷的限制排放【6】。 再者，植酸盐通过螯合作用还可降低动物对锌、锰、铁、钙、钾等主要微量元素的利用 率和通过与蛋白质结合成植酸复合物而降低动物对蛋白质的消化吸收率，从而使整个饲 料的利用率降低【2，5一。 植酸酶是催化植酸(肌醇六磷酸)及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类 酶的总称【1】。它使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷的排出量减少40％，从 而减少饲料中磷的添加量，它还可降解植酸盐的抗营养作用，因此对提高畜牧生产效益 及降低其对环境的污染有重要意义。 天然植酸酶来源广泛，包括植物、动物和微生物[10,11,24]。但由于前两者来源的植酸 酶作用范围和稳定性不好，且难以形成规模化生产，所以微生物来源植酸酶一直是人们 研究的热点。产植酸酶的微生物有丝状真菌、酵母和细菌等。丝状真菌是植酸酶存在的 主要领域，Shieh等(1968)119]对2