马铃薯酪氨酸酶的分离纯化及性质分析-药学专业毕业论文.docxVIP

叨川人学坝lj学何隆义马铃薯酪氨酸酶的分离纯化及性质研究 叨川人学坝lj学何隆义 马铃薯酪氨酸酶的分离纯化及性质研究 生物化学与分子生物学专业 研究生 胡源 指导教师 刘克武 摘要 从马铃薯中分离纯化出酪氨酸酶(Tyrosinase，EC．1 14．1 8．1)，并对 其理化性质进行了研究。首先用已酸一乙酸钠缓冲液对马铃薯匀浆抽提， 经分段特析，DEAE．Sepharo se．F．F离了交换柱层析，Sephadex G—l 50分了 筛层析等纯化步骤，所获酶液经SDS—PAGE检验为单一蛋门区带，说咧达 到电泳纯。纯化倍数为50，酶比活力为170．03U／mg蚩门，亚基相对分子 质量为42KD。以3，4一二羟基苯丙氨酸(L．DOPA)为底物做酶学性质分析， 测得Km为3 70mmol／L，最适温度为30。C，最适pH为7．50。晦在pH5．60 8．OO范围和40℃以下比较稳定，当温度从20℃升到40℃，相刘酶活仪 仪下降r 4％，而当温度从50℃上升到70℃，相埘酶活从84％迅速下降到 5％。 弓铃薯酪氨酸酶具有单酚酶和：酚酶活性，用L．酪氨酸、L一3，4_羟 基苯丙氨酸、邻苯二酚和氯原酸为底物，测得其单酚酶活性较低，并且存 纯化过程中活性丧失很快，而二酚酶{苫性较高并且较为稳定，其中以邻苯 二酚为底物时活性最高。酪氨酸酶足‘种会属酶，选用Na+、K+、Mg”、 Ca”、Cu”、Hg”、Zn”、Fe”八种金属离子和EDTA作用于酪氨酸酶， 发现Na+无显著作用，K+、Mg“、Ca2+、cu”、H92+刈酶具有不I刊程度的 抑制作j【fj，其rrl Hg”的抑制作用最强，而zn”、Fe2+具有不I—J程度的激活 作川。选用CaCl2和KCI作为抑制剂， 以L-DOPA为底物，表明CaCl2崩 非竞争性抑制，KCI为竞争性抑制，用 Lineweaver—Burk作图法求得其抑 制常数Kj分别为1 制常数Kj分别为1 J 68mmol／L和10mmol／L。EDTA足一种金属离子螫和 剂，存0．5 mmol／L浓度水平上对酶活抑制率达到56％。 巯基类化合物、抗坏血酸和曲酸对酶具有较强的抑制作用，同一浓度 范围内它们对酶的抑制强弱依次为_硫苏糖醇，B一筑慕乙醇L一谷胱廿肽 L一半胱氨酸抗坏血酸曲酸硫脲。选用曲酸进行酶活抑制机理研究， 预处理温度和预处理时间对曲酸的抑制率并无显著影响，曲酸通过延长 L-酪氨酸加氧羟化的迟滞时问，降低酶反f、i速度，从而抑制单酚酶活性， 以L-DOPA为底物测得曲酸为竞争性抑制，抑制常数Ki为0．1 7 mmol／L。 紫外光谱表明曲酸能将产物o-醌还原成：酚，抑制第二步反应的继续进 行，从而抑制黑色素的生成。 关键词 马铃薯： 酪氮酸酶； 分离纯化： 性质； 抑制作用 叫JII火学顺q-,学位论文Isolation，Purification 叫JII火学顺q-,学位论文 Isolation，Purification and Properties of Tyrosinase from Potato Major Biochemistry and Molecular Biology Graduatc HU Y Elan Advisor Li u Kewu Abstract：Tyrosinase(EC．1．14．18 1、was isolated and purified from potato and its biochemical properties veas studied Potato tyrosinase was purified to electrophoretic homogeneity by homogenate，salting—out，chromatography with DEAE—Sepharose F．F and Sephadex G一1 50．The purification multiple was 50 and the specific activity was 1 70．03U／rag．The molecular weight is 42KD with SDS—PAGE．The enzyme kinetic properties against L-DOPA were studied．The Michaelis constant(Km)was 3．70 mmol／L，the optimum pfl value ol’the enzyme was 7．5 and the optimum temperature-was 30℃The enzyme was stable within pH 5．60-8．00 an