抗耻垢分枝杆菌GlmU蛋白抗体的制备及glmU反义RNA表达的检测-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 生鳘 签字日期：乏坐上年』月卫目 学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、 使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机 构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。 论文作者签名： 宝望 指导教师签名：墨鱼茎 签-7-E]期：．．2窆竺2年三月上日 抗耻垢分枝杆菌GImU蛋白抗体的制备 抗耻垢分枝杆菌GImU蛋白抗体的制备 及glmU反义RNA表达的检测 硕士生姓名： 申 慧 指导教师： 马郁芳教授 指导小组： 辛 毅 教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘 要 分枝杆菌具有特殊的细胞壁结构，其核心部分由肽聚糖、聚阿拉伯糖半乳糖 和分枝菌酸组成，其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通过衔接双糖(L．鼠李糖．D．N． 乙酰葡糖胺)共价连接到肽聚糖大分子上。UDP-N．乙酰葡糖胺是N．乙酰葡糖胺的 糖基供体，而glmU基因编码的GlmU蛋白具有葡糖胺．1-磷酸乙酰基转移酶活 性和N一乙酰葡糖胺．1．磷酸尿苷转移酶活性，参与UDP．N．乙酰葡糖胺的生物 合成过程。本实验室张文利的研究结果表明，glmU基因为分枝杆菌生长必需基因， 因此，G1mU可作为研发抗结核新药的作用靶标。 为了深入研究GlmU酶活性对分枝杆菌细胞壁结构和组成的影响并建立筛选 GlmU酶抑制剂的细胞模型，本实验室己构建了glmU反义RNA表达载体 pMind·glmU-AS，glmU反义RNA在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的 表达受四环素的调控。为了优化四环素浓度对glmU反义RNA表达的调节，需要 用抗GlmU抗体检测GlmU在耻垢分枝杆菌中的表达量。 本论文的目的是：(1)用PCR法从耻垢分枝杆菌me2155菌株基因组DNA中 扩增glmU基因，构建pMDl8-glmU克隆载体；(2)将glmU基因亚克隆到pET29b 表达载体中，在宿主菌BL21(DE3)中诱导表达GlmU重组蛋白。用亲和层析法纯 化重组GlmU蛋白，并用Western Blotting方法鉴定GImU重组蛋白：(3)用纯化 的G1mu蛋白免疫小鼠以制备抗GlmU的多克隆抗体：(4)用不同剂量的四环素 诱导glmU反义RNA在耻垢分枝杆菌中的表达，用抗GlmU抗体检测GlmU在耻 垢分枝杆菌中的表达量。 本论文所获得结果如下： 1．glmU基因的扩增和pMDl8一glmU克隆载体的构建 用结核分枝杆菌GImU的氨基酸序列从TIGR的耻垢分枝杆菌me2155菌株基 因组数据库中获得mc2155菌株的glmU基因的核苷酸序列(1449 bp)。根据该序 列设计一对PCR引物，并在上游与下游引物的5’端分别引入Nde 列设计一对PCR引物，并在上游与下游引物的5’端分别引入Nde I和XhoI限制性 内切酶位点。用保真度高的LA Taq DNA聚合酶，以me2155菌株基因组DNA为 模板扩增了glmU基因，并将glmU基因连接到pMDl8一T载体，构建了pMDl8-glmU 克隆载体。对glmU基因进行DNA测序测定，结果表明利用PCR技术扩增出正确 的me2155 glmU基因。 2，表达载体pET29b．glmU的构建 用NdeI和XhoI双酶切pMDl8一glmU质粒，回收和纯化glmU基因，将其连 接到pET29b表达载体的NdeI和XhoI位点，构建了pET29b．glmU表达质粒。GlmU 蛋白的C端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。 3．GlmU蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)@表达和纯化 将pET29b．glmU质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，用IPTG诱导携带 pET29b．glmU质粒的BL21(DE3)表达重组蛋白。用超声方法破碎诱导后的 BL21(DE3)，对上清和沉淀组分进行SDS．PAGE和Western blowing分析，结果表 明GlmU蛋白在BL21(DE3)中可溶性表达。 采用组氨酸．Ni2+亲和层析技术纯化GlmU蛋白，