抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后血管狭窄的实验研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

中文摘要抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后 中文摘要 抗骨桥蛋白抗体防治内皮剥脱术后 血管狭窄的实验研究 摘 要 经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)术后血管再狭窄(restenosis，RS) 是一个过度的创伤愈合过程。平滑肌细胞的增殖和迁移、细 胞外基质的异常积聚以及血管重塑是造成再狭窄的主要原 因。在PTCA术后血管再狭窄的发病过程中，骨桥蛋白 (osteopontin，OPN)的表达水平与血管损伤后内膜增生的 程度明显相关，并在其中发挥着重要的作用。为此，我们利 用本室制备的抗OPN多克隆抗体，观察其防治PTCA术后 血管再狭窄中的治疗效果，并初步探讨其机理。 方法 1动物模型的建立：实验动物常规麻醉消毒；沿颈部正 中线切口，于气管左侧分离左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内 动脉；于颈外动脉剪一楔形切口，球囊导管自切口处经颈总 动脉插入至胸腹主动脉远心端，充盈球囊后将其拖回到胸主 动脉起始部，如此反复三次；球囊减压后退回至颈总动脉近 心端，再次充盈球囊，其余操作同上；退出球囊，颈内动脉 血流恢复后，关闭切口。术后当天分别经尾静脉注射兔抗鼠 OPN多克隆抗体(治疗组)及正常兔血清(模型组)，每次 O．5ml，每隔两日给药一次，共给药七次。 2实验标本的处理：术后2l天时，经右侧颈总动脉放 血处死大鼠，收集血液，左颈总动脉及主动脉标本。取颈总 中文摘要动脉中段血管病理切片，HE染色观察血管壁的增生情况并 中文摘要 动脉中段血管病理切片，HE染色观察血管壁的增生情况并 进行形态测量学分析；提取主动脉总蛋白，明胶酶图分析检 测血管壁中MMP一2活性的变化；Western Blot检测血管壁 中MMP．2含量变化；病理切片免疫组织化学染色观察其中 MMP一2及其抑制剂TIMP．2的表达变化；分离白细胞，用 FCM检测白细胞粘附分子CDlla和CDllc的表达变化。分 离胸主动脉血管细胞，测量粘附分子ICAM．1的表达变化。 结果 1动物的一般状况：实验过程中大鼠饮食正常，毛发平 整，精神状况良好，实验前后两组大鼠的体重均无明显变化。 尾静脉注射兔血清后大鼠体温逐渐上升，一般在8小时后体 温达到高峰，24小时后，基本恢复正常。治疗期间，前两 次给药后大鼠体温波动比较明显，第三次后波动幅度逐渐下 降，第五次给药体温不再出现明显的变化。模型组和治疗组 间没有明显差异。 2形态学和形态测量学变化：病理切片镜下观察发现， 血管内皮剥脱术后2l天，内膜弥漫性增生，管腔面积明显 减小，增厚的内膜中细胞数量明显增加，中膜细胞排列紊乱， 提示本实验成功构建了内皮剥脱血管狭窄的动物模型。与模 型组相比，经抗OPN抗体治疗后：血管内膜面积显著下降 (模型组0．18±0．01mm2，治疗组0．08±0．01 mm2，p0．05)； 内膜面积／中膜面积(I府讧)明显下降(模型组1．14±0．21， 治疗0．50±O．21，p0．05)，血管管腔面积扩大(模型组O．18 ±0．02 mm2，治疗组O．26±0．01 mm2，p0．05)：以上统计 结果表明，抗OPN抗体能够抑制大鼠血管内皮损伤后血管 内膜的增生，使管腔狭窄的状态得以改善。 中文摘要3 中文摘要 3 MMP-2含量及活性的变化：明胶酶图分析结果显示， 血管组织中MMPs以MMP．2为主。与模型组相比，经抗 OPN抗体治疗之后MMP-2的活性出现了明显的下降。 Western blot分析结果显示，模型组和治疗组均可测得 MMP一2的显色条带，灰度扫描未发现二组之间存在差别。 因此，抗OPN抗体能够抑制血管组织中MMP-2的活性， 但并不影响其表达或分泌。免疫组织化学分析结果与此类 似，两组之间TIMP一2的表达也无差异。 4白细胞及主动脉血管细胞粘附分子的表达变化： FCM分析表明经抗OPN抗体治疗后，白细胞表面CDlla的 总体标记率没有明显的变化，但标记细胞CDlla表达水平 出现了显著的下降(模型组6．19±0．41，治疗组5．48±0．33， p0．05)；而白细胞表面CDllc的标记率存在下降的趋势(模 型组35。l±6．7％，治疗组23。0±4。O％，p0．05)，但标记细 胞CDllc表达水平未出现明显的区别；血管细胞IC舢Ⅵ．1 标记率及表达水平均没有明显的变化。可见抗OPN抗体对 白细胞粘附分子的表达和白细胞的活化具有不同程度的抑 制作用，但不影响ICAM-1的表达。这也间接的说明，在血 管炎症早期，OPN对于白细胞和血小板募集于受损部位具 有重要作用。 结论 1成功建立了大鼠颈总．主动脉内膜联合剥脱的动物模 型。 2兔抗鼠OPN多克隆抗体能够有效抑制血管内皮剥脱 后新生内膜的增殖，进而抑