马传染性贫血病病毒L株前病毒全基因组克隆及序列分析-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

硕士攀位论文 马.fttJ险性贫血瘸病毒 L 稼病毒金基因组Jt.及序列分析 东北农业大学 摘要 马传染性贫血病病毒 CEquine infectious anemia virus ，EIAV) 是马传染性贫 血病 C Equíne infectious anemia ，EIA) 的病原。它与人免疫缺陷病毒( Human immunodeficiency virus ，HIV) 同属于反转录病毒科慢病毒肩，二者在病毒形态、基 因组结构、遗传性、抗原性、细胞嗜性、变异性等方面都极为相似，因此， EIAV 可作为 研究 HIV 分子致病机理的动物模型。我国的 EIAV 弱毒疫苗是迄今为止世界上唯一投入应 用的慢病毒疫苗，成功地控制了我国 EIA 的流行。该毒株是由 EIAV L 株 (EIAVL) 通过 驴体传代，使其毒力明显增强，然后在驴自细胞培养物上连续传代致弱获得的。为揭示 我国马传贫弱毒疫苗毒力致弱的分子机制，为 HIV 及其他慢病毒疫苗的设计和研究提供 有价值的理论依据，在己测得马传贫驴强毒 (Donkey-adapted equine infectious anemia virus ，DA-EIAV) 及驴白细胞弱毒 (Donkey leukocyte attenuated eQuine infectious anemia virus ，DLA-EIAV) 全序列的基础上，我们对 EIAV L 株前病毒进行了全基因组 克隆和序列测定。 /本研究以 EIAV L 株感染马的外周血液白细胞即 A 为模板，利用 PCR 技术，分囚个 片段扩增 EIAV L 株前病毒 DNA ，并分别克隆到载体质粒pBluescript SK 中，再经亚克 隆最终得到 EIAV L 株前病毒金基因克隆 pLVo 该前病毒基因组全长 8235bp ，其中G+C 含量为 38%。基因组两端是长为316bp 的 LTR ，其中山区长为197bp，R 区为 80bp ，山 区为 39bp。前病毒基因组有三个较长的开放阅读框架 (ORF) ，分别是gag，pol 和 env 基因。 gag 基因位于 713-1912 位碱基之间，全长 1200bp; pol 基因位于 1708-5109 位碱 基之间，全长 3402bp: env 基因位于 5305-7896 位碱基之间，长 2592bp 。此外前病毒还 有三个小的 ORF，Sl 位于 5113-5265 位碱基之间，长 153bp，S2 位于 5279-5482 位碱基 之间，长 204坤， S3 位于 7245-7646 位碱基之间，长 402bpo 通过使用计算机软件 DNAsìs 分析， EIAV L 株与 DA-EIAV 和 DLA-EIAV 序列同源性分 别为 98.4%和 96. 9%0 同源性如此接近反映了它们之间的亲缘关系，另外 EIAV L 株与 DA-EIAV 的同源性高于其与 DLA-EIAV 的同源性，这符合 DLA-EIAV 的衍生过程。 EIAV L 株与国外已发表的一些相关毒株相比核昔酸序列差异很大，同源性只有 79%. RTase 的 氨基酸同源率只有 86%， Gag 蛋白的同源率只有 79%，说明白的L 株与国外己报道的几 个 EIAV 毒株的亲缘关系较远。 尽管 EIAV L_ DA-EIAV 及 DLA-EIAV 毒株与国外的几株 EIAV 病毒差异很大，但是在 EIAV 生命周期中起重要作用的几个己知功能区是保守的。 P9 的 YXXL 基序、 Pl1 的两个 铸指结构以及大多数反转录病毒蛋白酶中均具有的 N 端 D-T-G基序和 C端的 L/I-G-R-O/N 基序在所有的毒株中都是一致的:各毒株 Gp90 有六个忡连接糖化位点位置高度保守: Gp45 有四个 N-连接糖化位点在所有毒株中均是保守的，并且在免疫决定区内对维持 Gp45 构象起重要作用的两个 Cys 在所有毒株中的位置是保守的; Tat 蛋白中起转录激活作用 的核心区在各毒株中完全一致，基本区中对与 TAR 结合所必须的 Glu 在各毒株中的位置 也完全保守; Rev 蛋自的基本区在各毒株之间也很保守.这些保守区的确立，为进一步 研究 EIAV 的结构与功能提供了极有价值的信息. ，.，刘缸金 摘要 2ω1 年5 月 ，.， EIAV L 株的 pol 基因在重叠区没有起始码 ATG ，DA-EIAV 、DLA-EIAV 株也是如此: 对 EIAV 各毒株 gag-po} 重叠区 5 端分析表明，都存在一个保守的茎-环结构