抗骨桥蛋白抗体防治动脉粥样硬化的实验性研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

中文摘要一————二———————————————————————一 中文摘要 一————二———————————————————————一 抗骨桥蛋白抗体防治动脉粥样 硬化的实验性研究 摘 要 目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种心血管 系统的炎症性疾病，炎症反应贯穿于AS的整个病理过程。骨 桥蛋白(osteopontin，OPN)是细胞外基质的一种粘附性蛋 白，可由增殖活跃的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle celL vsMc)合成和分泌，具有诱导细胞粘附及迁移的作用。 此外，OPN还具有类细胞因子的作用，参与炎症反应。在 AS发生发展过程中，OPN发挥着重要作用。本实验以抗OPN 抗体为药物通过静脉给药阻断血管损伤部位OPN的功能， 观察了对AS的防治作用，并对其作用机制进行了初步探讨。 方法： 1．动物模型的建立及分组：将12只SD大鼠随机分为 两组，模型组和预防组，每组6只。模型组，连续三天灌胃 给予VitD3(总量为50万单位／kg)，之后用高脂饲料以159／ 只／天喂养2l天。预防组，在给予ⅥtD3灌胃和高脂饲料的 同时，经尾静脉注射抗OPN单克隆抗体(滴度为1：1000)， 其用法为：0．5ml／次，隔日一次，共7次。实验前及实验后 分别测大鼠的体重。每次注射抗OPN抗体后O、2、4、6、8、 lo、12小时及24小时测肛温。实验中观察大鼠的一般情况。 两组动物分别于实验前及实验开始后10天、17天及24天取 血，分离血清，用于C一反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子 一Q(TNF—a)和Ca2+含量的测定，并于最后一次取血后将大 中文摘要鼠处死，留取主动脉血管进行病理切片、平滑肌Q一肌动蛋 中文摘要 鼠处死，留取主动脉血管进行病理切片、平滑肌Q一肌动蛋 白(SM—Q actin)免疫组化染色、OPN Western印迹和组织C一+ 含量的测定。 2．SM．Q actin免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡，微波 抗原消化5min。封闭液室温孵育10min。加入1：1000稀释的 特异性SM．Q actin单抗(阴性对照用PBS代替)，湿盒4。C 过夜。继而依次与生物素标记的二抗(1：1000稀释)和辣根 酶标记的链霉卵白素于37℃孵育15min。用DAB显色。 3．OPN Western印迹分析：取对照组和预防组大鼠主动 脉蛋白提取液进行SDS．PAGE，电印迹转至硝酸纤维素膜上， 依次与一抗、二抗进行结合反应，Western印迹结果用凝胶 成像分析系统进行定量分析。 4．血清及组织Ca2+含量的测定：用全自动生化分析仪测 定，具体操作按试剂盒说明书进行。 5．血清中炎性因子含量的测定：采用免疫浊度法测定 CRP含量，用放免平衡法测定TNF—Q含量。 结果： 1．一般情况的变化：实验前后两组大鼠的体重基本上无 多大变化，两组间无明显差异。预防组大鼠前四次尾静脉注 射抗0PN抗体后，体温在8小时之内升到最高，达38．4+0．14 ℃(P0．05)，之后体温下降，从12小时到24小时，体温基 本降至正常范围内。后三次注射抗体后，体温不再出现升高 的现象。整个实验过程中，模型组大鼠的体温在正常范围内 波动。两组大鼠的一般情况良好。 2．形态学变化：主动脉切片显示，模型组可见血管内皮 下间隙增宽，内含小空泡，有些部位可见大空泡；中膜VSMC 中文摘要增生，排列紊乱或隆起，中膜弹性膜紊乱、断裂；有些部位 中文摘要 增生，排列紊乱或隆起，中膜弹性膜紊乱、断裂；有些部位 有明显的钙化形成，钙化区周围可见到泡沫细胞。预防组仅 见少许泡沫细胞分布于病变部位；中膜VSMC排列也较紊 乱，但增生较轻；弹性膜轻度紊乱、偶见断裂；钙化区较少 且不明显，未见到大空泡的形成。结果提示，预防组的病变 程度较模型组轻。 3．血管壁中VSMC表型标志蛋白的表达变化：SM．Q actin是分化型VSMC的标志蛋白。免疫组化结果表明，模 型组血管壁中阳性染色颗粒较预防组少，而且着色也较淡。 OPN是去分化型VSMC的标志蛋白。Western印迹分析表明， 模型组OPN的表达量是预防组OPN表达量的1．2倍。SM． d actin的变化与AS病变程度成反相关，而OPN的表达量 与AS病变程度成正相关。上述结果提示，AS病变部位的部 分VSMC由分化型变为去分化型，导致SM．Q actin合成减 少，OPN合成增加。给予抗OPN抗体后，通过中和动脉壁 损伤部位的OPN，在一定程度上抑制了VSMC表型转化， 起到减缓AS进展的作用。 4．血清及组织ca2+水平的变化；模型组和预防组10天 时的血Ca2+水平显著升高(P0．05)，随着时间的延长，两组 的血Ca2+含量又呈下降的趋势，17天和24天的