绵羊外周血中游离DNA应用于胎儿性别鉴定以及基因分型的初步研究-养殖专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 SHIHEZI UNIVERSITY MASTER’DEGREE DISSERTATION The preliminary research on free DNA of sheep’s peripheral blood was applied to the fetal gender identification and genotyping by HRM A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agricultural Extension By Jiang Li-Bin (Animal Genetics, Breeding and Reproduction) Dissertation Supervisor：Researcher. Shi Guo-qing Dissertation Supervisor：Associate Researcher. Zhang Yun-sheng May，2014 Shihezi.Xinjiang.China 项目资助 本研究由以下项目资助： 1、科技支撑计划“优质肉、毛羊新品种（系）选育与关键 技术研究及示范” 2、兵团国际科技合作项目“基于血浆DNA开发牛、羊妊娠诊 断及FecB基因高效分型技术研究” 3、新疆兵团科技攻关“细毛羊新品系选育与高效养殖创建 示范” 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知， 除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果.对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意. 帆险制 时间: 2014 年 6 月 5 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国 家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版.有权将学位论文用于赢利目的的少量复 制并允许论文进入学校图书馆被查阅.有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索.有权 将学位论文的标题和摘要汇编出版 .保密的学位论文在解密后适用本规定. nh帆布时间: 2014 年 6 月 5 n h帆布 时间: 2014 年 6 月 5 日 摘 要（中文） 目的：外周血中游离的 DNA 主要是指存在于血浆，血清等循环系统里的一些小片 段 DNA。它是机体代谢的正常生理表现，但是在一些病变或类病变机体中这类游 离的 DNA 的含量和组成会发生变化。这些研究结果在一些疾病的临床诊断以及非 创伤性早期妊娠诊断方面给人们提供了一个新的检测诊断方法。本研究应用三种 方法从绵羊外周血浆/血清中分离提取游离 DNA，建立高效的外周血游离 DNA 提 取方法，并对 SRY 基因进行 PCR 扩增开展早期胎儿性别鉴定，同时对利用游离 DNA 进行基因突变筛选的可行性做初步的研究。 方法：1、绵羊外周血中游离 DNA 提取及 SRY 基因检测。利用加热法、酚氯仿法 以及试剂盒从 500μL 血浆/血清中提取游离的 DNA。根据游离 DNA 片段的特点分 别设计扩增产物为 168 bp 的 MC1R 检测引物和 178 bp 的 SRY 基因引物进行普通 PCR 检测。 2、不同妊娠时期胎儿性别鉴定。利用试剂盒提取血浆样品中游离 DNA， 设计巢式 PCR 引物，优化扩增体系。对 SRY 基因特异性扩增，并统计各个妊娠阶 段的检测结果与分娩结果分析。 3、利用酶切及 HRM 技术对血浆 DNA 中绵羊 FecB 基因进行分型效果研究。 结果：1、利用加热法、酚氯仿法、试剂盒法都提取到了游离的 DNA，PCR 后通过 琼脂糖凝胶电泳检测到了 168 bp 的目的片段。同时利用 PCR 扩增到了 178 bp 的 SRY 基因目的片段。 2、通过对结果分析显示，阳性检出率随着妊娠时期的推移而增加。3wk-6wk 以内总共 17 个样本其中 SRY 检测结果阳性为 11 个，分娩结果公羊为 10 只，SRY 检出率为 88.2%（10/11）。6wk 以上 23 个样本，SRY 检测阳性样本为 17 个，分 娩结果公羊为 17 只 SRY 基因检出率达到 88.2%（15/17）。 3、利用高分辨率熔解曲线（HRM）技术对绵羊 FecB 基因多态位点分型结 果与测序后结果相比较准确率达到 95.83%。 结论： 1、不同的提取方法均可有效提取分离绵羊外周血血清和血浆中游离的 DNA 片段，能够用于 SRY 基因的检测。