绿僵菌细胞壁合成相关基因MaFKS和MaChsⅦ的克隆及功能分析-微生物学专业毕业论文.docxVIP

Functional analysis of genes MaFKS and MaChsⅦ related to cell wall synthesis in Metarhizium acridum A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Science By Min Yang Supervised by Prof. Yuxian Xia Major: Microbiology College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China April, 2011 中文摘要 中文摘要 重庆大学硕士学位论文 重庆大学硕士学位论文 I I PAGE PAGE IV 摘 要 绿僵菌（Metarhizium acridum）作为重要的昆虫病原真菌之一是控制自然界害 虫种群数量的其中一个重要因素。它具有主动穿透昆虫体壁、致病过程复杂不易 产生抗性等特点，在日益受到人们重视的生物防控上具有广阔的应用价值。然而 它也具有一定的缺点，如架货期短、容易受到环境条件的影响、成本高等。真菌 的细胞壁可以根据真菌的整个生活周期和外界环境的变化而不断的改变，并且是 真菌和环境接触的媒介，在保护细胞免受外界有害环境的损害以及真菌的整个生 活周期中起重要作用。然而，目前对昆虫病原真菌细胞壁的研究还较少。 本研究以绿僵菌为实验材料，在已知基因组序列的基础上，克隆了 β-1,3-葡聚 糖合成酶基因 MaFKS 和丝状真菌特有的 VII 类几丁质合成酶基因 MaChsVII，并采 用基因干扰和基因敲除技术对它们的生物学功能进行了分析。 主要研究结果如下： 1 MaFKS 的克隆与功能分析 1.1 MaFKS 的克隆及序列分析 我们根据已知的基因组 DNA 序列设计引物克隆得到β-1,3-葡聚糖合成酶基因 命名为 MaFKS，基因登录号为 HQ441252。该序列开放阅读框为 5820bp，编码一 个 1938 个氨基酸的蛋白。使用在线工具预测该蛋白分子量为 221.7kDa，等电点为 7.94。预测 MaFKS 蛋白含有 16 次跨膜区域，与其他丝状真菌中葡聚糖合成酶同源 性较高。与基因组 DNA 序列比对发现，MaFKS 基因含有两个内含子，分别在 N 端（177-238 bp）和 C 端（5539 bp-5600 bp）。 1.2 利用 RNAi 技术对 MaFKS 基因的功能进行分析 为研究 MaFKS 基因的功能我们构建了农杆菌介导的干扰载体 （pPK2-pB-MaFKS-RNAi），采用农杆菌介导的丝状真菌的遗传转化方法转化绿僵 菌后，获得 5 个干扰转化菌株。采用定量 RT-PCR 的方法检测了干扰菌株中 MaFKS 基因的表达量。结果表明，不同的干扰菌株的干扰效率在 40%-64.2%之间。 1.3 MaFKS 基因与细胞壁的完整性相关 我们分析了 MaFKS 基因干扰菌株在含有不同细胞壁干扰剂的培养基上的菌落 生长，发现与野生菌株相比，干扰转化菌株在含有刚果红、荧光增白剂或 SDS 的 PDA 平板上的菌落形态明显不同。我们近一步在显微镜下观察了干扰菌株与野生 菌株菌丝生长的差别。观察发现，在含有 CR、 CFW 的 PDA 平板上可观察到野 生菌株有大量的分支的气生菌丝。相反，干扰转化菌株仅有少量的没有分支或只 有少数分支的气生菌丝。在液体培养基中，转化菌株的大部分菌丝元素与野生型 没有差异，但在 CR 存在的条件下菌丝的尖端或内部隔室出现膨胀。 1.4 MaFKS 基因与绿僵菌高渗透压的耐受性相关 在含有 KCl 的 PDA 平板上，干扰转化菌株的基内菌丝比野生型明显减少。并 且转化菌株的的菌落表面光滑且呈黄褐色，而野生菌株的菌落表面则褶皱且变绿。 干扰转化菌株在含有山梨醇或甘露醇的 PDA 平板上，与野生型相比转化菌株只有 稀疏的气生菌丝。这说明 MaFKS 影响绿僵菌对高渗透压的耐受性。 1.5 干扰 MaFKS 基因后绿僵菌的产孢量降低 测定干扰转化菌株和野生菌株在 PDA 平板和含有 CR、CFW、SDS、KCl、山 梨醇和甘露醇的 PDA 平板上接种 12 天后的产孢量。发现在 PDA 平板上两菌株的 产孢量差别不大，但在含有 CR、CFW、SDS、KCl、山梨醇和甘露醇的平板上， 干扰菌株的产孢量明显降低。 1.6 干扰 MaFKS 基因后菌丝的葡聚糖含量降低 测定菌丝壁β-1,3-葡聚糖的含量，发现干扰转化菌株β-1,3-葡聚糖的含量只有 野生菌株的 51.3