绿色荧光蛋白的定点突变及新型T载体构建研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

摘要 TA 克隆是最简洁、高效的克隆 PCR 产物的方法之一，在没有合适的酶切位点来 进行载体间的 DNA 片段亚克隆时尤其有用。T 载体具有 3?末端单一的 T 凸出尾，使 其能够直接与 3?端具有 A 凸出尾的 PCR 产物高效连接。常用 T 载体的不足之处在于 需要 IPTG 诱导和 X-gal 显色剂，例如蓝白斑筛选；或者菌株生长不稳定，如利用毒 蛋白或杀菌肽构建的 T 载体。最近绿色荧光蛋白(GFP)被用于构架 T 载体的筛选试剂， 插入片段和 T 载体的重组菌落可以在可见光下进行鉴定，但是仍然需要 IPTG 诱导。 本实验使用一种新型 GFP 突变体 Emerald 作为细胞荧光指示剂，构建新型灵敏的 T 载体。主要结果如下： 1、定点突变：定点突变绿色荧光蛋白突变体 EGFP(F64L–S65T–H231L)，获得 4 个氨基酸残基突变的 Emerald 突变体(S72A, N149K, M153T 和 I167T)。 2、胞外分析：构建大肠杆菌 Emerald 的表达载体 p28SUMO-emerald。表达并纯 化重组蛋白 Emerald，并分析其紫外可见光谱和荧光扫描光谱性质与报道一致。重组 Emerald 在 Hampton Screen ⅠⅡ的第 39 号条件：2 mol/L(NH4)2SO4，0.1 mol/L HEPES-NaOH , pH 7.5, 2% PEG400 中晶体生长最优，为柱状晶型。 3、胞内分析：Emerald 基因连入 pUC18 载体后，上游添加增强子以增强表达效 果，在不加 IPTG 和 X-gal 的条件下， 37℃培养 18 小时，大肠杆菌重组菌落在可见 光下显示绿色。添加增强子后，菌液每毫克上清总蛋白荧光强度提高至原来的 3.3 倍。 4、同义突变：根据 GFP 的三维结构预测结果，分别在 Emerald 突变体第 4 和第 5 个 β 折叠片层结构上选择了 2 个突变位点，即第 93 位的 V 和第 109 位的 R，分别 创建 SnaBⅠ和 SmaⅠ酶切序列。 5、T 载体构建及验证：构建 pESN-T 和 pESM- T 载体。将约 500bp 外源 PCR 片 段分别与两种 T 载体连接，重组菌斑为白色，对照在可见光下为绿色。 6、插入突变：为了验证 T 载体的灵敏性，利用定点突变的方法分别在 pESN 和 pESM 载体的 SnaBⅠ和 SmaⅠ酶切位点识别序列中间添加一个三核苷酸序列 TCC。 平板转化以 及菌液上 清总蛋 白荧光强 度分析 显示绿色 荧光消失 ，插入 突变后的 Emerald 蛋白在包涵体中表达，折叠性和表达量均受到大幅度影响。 综上所述，本文研究了绿色荧光蛋白突变体 Emerald 在大肠杆菌胞外和胞内性 质，选取两个限制性内切酶位点 SnaBⅠ和 SmaⅠ作为插入位点构建 T 载体，并构建 插入一个三核苷酸序列 TCC 的突变载体，转化后菌落荧光强度几乎为零，蛋白表达 量以及折叠性均大幅度下降。本研究构建的 T 载体目前最灵敏，具有良好的应用价值。 关键词：绿色荧光蛋白，晶体生长，T 载体，大肠杆菌，菌落绿色荧光 I II II Abstract The TA cloning technique is one of the simplest and most efficient methods for the cloning of PCR products, and it is especially useful when compatible restriction sites are not available for sub cloning. DN A fragments from one vector into another. A T-vector contains a single T extension at the 3? terminal that permits efficient ligation of cloning PCR products having 3?-A overhangs. One major disadvantage of common T vectors in the blue-white screening system is the demand of IPTG and X-gal. Another disadvantage is the instability of recombinant colonies in the T vectors utilizing toxin or cecropin for direct screening positive colonies. Rece