课件：蛋白质的基本机构和功能.ppt

3.电泳 带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的 现象。 蛋白质在带电场中泳动的速度和方向与其所 带电荷的性质、数量及分子的大小、形状有关。 带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动 较慢，从而达到分离蛋白质的目的。 二、蛋白质的胶体性质 1.蛋白质有胶体性质 蛋白质是生物大分子，分子量在1万～10万Da之间，分子直径在胶体颗粒的范围（1~100nm），因此，蛋白质具有胶体的性质。 2.蛋白质亲水胶体稳定的因素 蛋白质分子表面的水化膜和同种电荷。去掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产生沉淀。 3.蛋白质胶体性质的应用 透析用于分离纯化蛋白质 超速离心用于蛋白质的分离纯化及分子量的测定。 变性的概念 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质 特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改 变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性。 变性的实质 次级键断裂，空间结构破坏 三、蛋白质的变性、沉淀和凝固 引起变性的因素 物理因素 高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。 化学因素 强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。 变性蛋白质的特点 A.生物学活性丧失 B.溶解度降低，易于沉淀 C.粘度增加 D.结晶能力消失 E.易被蛋白酶水解 蛋白质变性的应用 应用变性的因素进行消毒、灭菌。 保存生物制剂则要防止蛋白质变性。 蛋白质的复性 大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素，有些可恢复其天然构象和生物活性,称为蛋白质的复性。 牛核糖核酸酶的变性与复性 蛋白质沉淀 概念 蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。 方法 盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂沉淀。 变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生沉淀。沉淀的蛋白质易发生变性，但并不都变性，如盐析。 四、蛋白质的紫外吸收性质 蛋白质分子中含有共轭双键的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基，具有紫外吸收能力，在280nm处有最大吸收峰。此特性常用于蛋白质含量的测定。 五、蛋白质的免疫学性质 蛋白质作为大分子，往往具有免疫原性，同时，抗体也是蛋白质。 抗原（免疫原）：凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特异性结合的物质。 抗体：机体中因抗原刺激而产生的能与相应抗原特异结合并具免疫功能的免疫球蛋白。 单克隆抗体：由针对某一个特定抗原决定簇而分化、增殖而来的B淋巴细胞群合成并分泌的抗体。 六、蛋白质的呈色反应 1. 双缩脲反应： 肽键与双缩脲试剂反应呈紫色；氨基酸无此反应，可用于检查蛋白质的水解程度。 碱性溶液中与Cu2+产生蓝色，mg级测定 2. 茚三酮反应: 酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色 3. Folin—酚试剂反应 碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色 范围:25-250μg(Tyr,Trp的反应) 1. 紫外分光光度法: 280nm, 0.1-0.5mg/ml (样品含核酸时)蛋白质(mg/ml)=1.55A280-0.75A260 2. 福林-酚试剂法: 碱性+Cu2++磷钼酸-磷钨酸→蓝色 范围:25-250μg(Tyr,Trp的反应) 七、蛋白质的含量测定 3. Biuret法： 蛋白质+碱性+Cu2++BCA试剂(4,4‘-二羧酸-2,2’-二喹啉钠)→紫色(562nm) 范围:10-1200μg/ml 4. Bradford蛋白分析法: 考马斯亮蓝G-250+乙醇+酸性→淡红色+蛋白质→蓝色(595nm) 范围:10-100μg/ml 5.双缩脲法 肽键+碱性+Cu2+→紫红色 范围:0.5-10mg/ml 6.凯氏定氮法 1g氮相当于样品含有6.25g蛋白质 第四节 蛋白质的分离纯化 一、蛋白质的提取 1. 选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便 2. 组织细胞的粉碎：胞内及膜中蛋白 物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等 化学法：如EDTA、SDS等 酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等） 3. 提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数 二、蛋白质的分离纯化 （一）根据溶解度不同 1. 等电点沉淀:蛋白质在pI时溶解度最小 2. 盐析(分级):大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中,破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀.各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同. 3. 低温有机溶剂沉