棉花GhPHOT1和GhPHOT2基因的克隆及功能鉴定-细胞生物学专业毕业论文.docxVIP

关于学位论文独立完成 和内窑创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位中情。本人知重声明:所呈交的学位论 . 本人在导师的指导下独立完成的，纣所研究的课题有新的几解. 屉4电所费。 文中特别加以说明 、标注和敢说t的地方外，论文中不包括其他，人已经发表J 写过的研究成呆，也不包括其他 人为获得任何教育、科研机构的学位或证 · 饮用过的材料.与我.一同二作的 同事对本研究所傲的任何贡献均已在论丈 了明确的说明并表示 7 谢意。 学位中诗人{学位论义作者)签名 主 号尺 20 r主. 正 j-月 (0 日 关于学位论 文著作权使用授权书 本人经河尚大学审核批准梭子硕士学位。作为学位论文创作者，本人; 7得并同意河南大学有关保留、饮用学位论文的要求 ，r 河南大学有权向| 图书馆、科研信息斗A构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文 {纭， 本和电子文本 }以供公众检索、查阅 。本人授权河南大学出于宣扬 、展览f 学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印 、缩印、.i3 画和拷贝等复 段保存 、ìC编学位论文 (纸质文本和电子文本 }。 (涉及保密内容的学位论文在解密后运用本j受权书) 学位获得者〈学位论文件〉签名 :豆豆 20 I - Jf.， j- 月/。日 / 1 ;: 1. 学位论文指导教师签名 : 摘 要 棉花是喜光喜温的植物，在世界各地都有种植。光照是棉花正常生长不可缺少的重 要因素之一，对棉花的产量和质量都有很大的影响。目前对棉花和光照关系的研究，主 要集中在光照时间和光照强度对棉花的影响，以及不同光质如红光和蓝光等对棉花产量 的影响，但有关棉花光受体的研究还未见报道。已有研究证明参与向光性的受体主要是 向光素、隐花色素和光敏色素。向光素是一种常见的光信号受体，参与蓝光诱导下植物 的向光反应、气孔开放和叶绿体运动等诸多反应。目前在苔藓、拟南芥和玉米等植物中 陆续发现了两种蓝光受体，分别为 PHOT1 和 PHOT2。PHOT1 和 PHOT2 的 C 末端含有 Ser/Thr 蛋白激酶区域，N 端含有与黄素单核苷酸结合的两个区域。PHOT1 在弱光下具 有捕光的作用，通过调节叶绿体聚光运动增强光合作用效率；PHOT1 和 PHOT2 在强光 下具有避光的作用，通过叶绿体避光运动和调节叶片伸张度减少强光对植物的危害。最 新研究表明，PHOT2 参与植物抗旱过程，通过调节气孔开度等一系列反应增强植物的 抗旱性。 本研究以拟南芥 AtPHOT1 和 AtPHOT2 蛋白序列作为探针，在 Phytozome 网站对雷 蒙德氏棉的蛋白数据库进行序列同源性比对，发现两个同源度分别为 73.9%和 72.4%两 个基因，基因编号分别为 Gorai.003G139300 和 Gorai.008G012600。通过同源性比对发现， 这两个基因与可可中的 PHOT1 和 PHOT2 为同源基因；蛋白结构分析表明，二者都有向 光素蛋白的典型结构，既 C 端为 Ser/Thr 蛋白激酶区，N 端含两个 PAS 结构域；KEGG 数据库显示这两个基因为棉花 PHOT1 和 PHOT2 基因，并命名为 GhPHOT1、GhPHOT2。 本实验分别在拟南芥和棉花中验证 GhPHOT1 和 GhPHOT2 基因的功能。首先将构 建好的棉花 GhPHOT2 基因的超表达载体，通过农杆菌侵染法侵染拟南芥 phot1phot2 双 突变体以及 phot2 单突变体植株，鉴定并筛选出阳性苗，叶片表型回补实验证明，与对 照植株相比， phot1phot2-GhPHOT2 双突变体阳性植株叶片表型得到回补；在 100 μmol.m-2.s-1 强蓝光下，以拟南芥 phot1phot2-GhPHOT2 和 phot2-GhPHOT2 阳性植株叶片 I PAGE PAGE IV III III 为材料，通过小孔透射、叶绿体运动和气孔开度实验，证明 GhPHOT2 基因参与调节叶 绿体的避光运动和气孔开度；亚细胞定位表明 GhPHOT2 蛋白定位在细胞膜或细胞壁上， 这与拟南芥中 AtPHOT2 的亚细胞定位情况是相符的。为进一步验证 GhPHOT1 和 GhPHOT2 基因的功能，我们通过 VIGS 技术使棉花植株内源向光素基因沉默，通过 RT-PCR 鉴定得到沉默植株，对照植株相比，结果发现在 100 μmol.m-2.s-1 蓝光照射下， GhPHOT1 和 GhPHOT2 沉默植株气孔开度降低。以上结果与拟南芥中得到的实验结论 是相辅相成的。 关键字：棉花，PHOT1，PHOT2，VIGS 技术 ABSTRACT Strong light and high temperature is suita