绵羊甲状腺中褪黑素的合成及其生理作用的研究-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docxVIP

Autonomic Biosynthesis and Functional Characteristics of Melatonin in Thyroid in Sheep A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Agriculture By Kepeng Ou (Animal Genetics) Dissertation Supervisor: Prof. Xiaojun Liu June, 2015 Shihezi, Xinjiang, China 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果 。据我所知， 除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果 。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意 。 研出名:户在什硝 时间 : voCS 年 6 月 7 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家 主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版 。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查 阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务 。有权将学位论文的标题和摘 要汇编出版 。保密的学位论文在解密后适用本规定 。 研究生签名:秩叮 i院 名 : γ 1/写 时间 : 识15年 4 月 7 日 时间 :叫叫月7 日 I I 摘 要 褪黑素（MEL）和甲状腺素（TH）是绵羊季节性繁殖调控通路中的两个重要激 素。MEL主要由松果体合成并分泌，在其过程中，5-羟色胺-N-乙酰基转移酶 （AA-NAT）和羟基吲哚-氧-甲基转移酶（HIOMT）是其最关键的两个酶。AA-NAT 是合成过程中的限速酶，而HIOMT是全部过程中的关键酶。TH则来自于甲状腺的合 成与分泌，并受促甲状腺素释放激素（TRH），促甲状腺素（TSH）的调控。最近在 实验动物小鼠的研究中证实，甲状腺存在有合成MEL所必须的AA-NAT和HIOMT两个 关键酶，并分布有褪黑素受体（MT1）。同时，在人和小鼠的甲状腺存在TRH及受体 （TRHR），以及促甲状腺素β亚基（TSH-β）的剪接变体，暗示甲状腺本身可能存在 对TH分泌自主调节的机制以及甲状腺合成的MEL可能参与了TH的合成调节。为了研 究绵羊甲状腺能否通过MEL自主调控TH的合成，进而影响绵羊季节性繁殖，开展如 下研究： 1、利用RT-PCR技术检测MEL合成的关键酶基因AA-NAT和HIOMT，以及MT1 和调控TH合成的相关基因TRH，TRHR，TSH-β，TSHR是否在绵羊甲状腺表达。在 mRNA水平确定绵羊甲状腺能否自主合成且分泌MEL，并参与调控TH合成。结果表 明：绵羊甲状腺表达MEL合成的关键酶基因和MEL受体基因，以及调控TH合成的基 因TRH，TRHR和TSHR，但不表达TSH-β基因。 2、通过双酶常规消化并分离得到甲状腺滤泡细胞，结合RT-PCR、细胞免疫荧光 和ELISA技术，对培养的绵羊甲状腺细胞从形态，甲状腺特异性基因mRNA和蛋白的 表达以及甲状腺素T3/T4的合成与分泌功能等方面进行鉴定， 确定所培养的原代细胞 功能完整性，建立绵羊甲状腺原代细胞培养体系。结果表明：成功地建立了简便可行 的绵羊甲状腺细胞的原代培养方法。为深入研究绵羊甲状腺的功能提供了实验平台。 3、采用组织免疫荧光，Western blot，ELISA等技术，验证绵羊甲状腺组织中MEL 合成的关键酶基因AA-NAT、HIOMT以及MT1的表达，进而利用体外培养的细胞，在 细胞水平验证绵羊甲状腺能否自主合成并分泌MEL，为进一步研究绵羊甲状腺自身合 成并分泌的MEL与TH合成的关系打下基础。结果表明：绵羊甲状腺具有自主合成并 分泌MEL的功能，绵羊甲状腺内部可能存在有通过MEL调控TH合成的新通路。 4、运用组织免疫荧光，ELISA，qPCR技术，检测外培养的绵羊甲状腺原代细胞 中TSH-β蛋白的表达，并用外源MEL对体外培养的绵羊甲状腺原代细胞进行处理，检 测细胞培养基中T3/T4的水平和甲状腺细胞TPO的表达量。确定绵羊甲状腺自主合成 并分泌的MEL是否调控TH的合成。结果表明：绵羊甲状腺组织不表达TSH-β蛋白， 自主合成并分泌的MEL在体外细胞水平与TH的合成之间没有关联，但是在外源MEL 的刺激下，TPO的相对表达量与对照组差异显著，表明MEL可能参与到甲状腺滤泡细 胞的抗氧化过程。 I