鳗鲡致病菌快速诊断试剂盒的研制及流行规律调查-水生生物学专业毕业论文.docxVIP

I I 鳗鲡致病菌快速诊断试剂盒的研制及流行规律调查 摘 要 鳗鲡是中国重要的养殖经济鱼类，自 70 年代末以来，很快发展成为中国出口创汇最 多的单项水产品之一。目前中国大陆的主要养殖品种有日本鳗鲡、欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡。 随着养殖集约化程度的提高，养殖环境日益恶化，鳗鲡病害成为困扰鳗鲡养殖业持续、健 康发展的重要因素，尤其是细菌性病害，发病广、传播快、死亡率高，给鳗鲡养殖业者造 成了巨大的经济损失。因此，快速的诊断疾病是有效防治的关键，但是目前对鳗鲡致病菌 的快速诊断试剂盒的研究缺乏，对鳗鲡细菌病害的流行规律调查也甚少。鉴于此，本试验 研制了 15 株主要鳗鲡致病菌免疫血清，并和实验室以往研制的 20 株主要鳗鲡致病菌免疫 血清，制成 35 种快速诊断试剂盒，对鳗鲡主产区福建省不同养殖种类、不同季节、不同 地区、不同规格的患病鳗鲡进行了检测，主要结果如下： 1. 抗血清的制备。本试验采用静脉注射免疫法制备了 15 株鳗鲡致病菌的兔抗血清， 并应用玻片凝集法对血清效价进行测定，结果显示：7 株菌的抗血清效价达到 2048，占 46.7 % ；3 株达到 1024，占 20 %；3 株达到 512，占 20 %；2 株达到 256，占 13.3%。 .抗血清交叉反应去除。采用玻片凝集法测定了每种免疫血清与其它 34 株鳗鲡致病 菌（与血清对应的致病菌株除外）的交叉反应效价，并采用非特异性吸附沉淀法对存在交 叉反应的血清进行了交叉去除，结果显示：具有明显交叉反应的血清有 15 种，占 42.9 %； 其中 9 种通过非特异性吸附沉淀法可完全去除，占存在交叉反应血清总数的 60 %，且 7 种去除交叉后的血清效价没有下降，2 种效价降低了 1 倍，去除交叉后的血清具有较高的 效价和特异性；其余 6 种不能完全去除交叉反应的血清，在实际检测时可通过稀释血清使 交叉反应不明显。 .抗血清的检测灵敏度。采用玻片凝集法测定了 35 种血清的检测灵敏度，结果显示： 检测灵敏度在 1×108 cfu/mL 以上的 24 种， 1×107 cfu/mL 以上的 9 种， 1×106 cfu/mL 以 上的 2 种。 4.应用乳胶凝集实验方法检测鳗鲡致病菌的研究。为了提高试剂盒检测灵敏度，防止 漏检，本试验在玻片凝集试验的基础上对乳胶凝集试验条件进行了探索。应用 A 蛋白亲和 层析纯化后的抗体（S18 和 S31）致敏乳胶，并设计了不同偶联时间、抗体加入量、致敏 时间和封闭时间的乳胶致敏效果对比试验，结果表明：碳化二亚胺（EDC）偶联 3 h，加 入纯化抗体量 588.6 μg/ml（S18）； 568.7 μg/ml（S31），25 ℃、200 r/min 致敏 10 h，然后 加入甘氨酸于 25 ℃、200 r/min 封闭 30 min，得到的致敏乳胶抗体与对应抗原反应效价最 高，达到 512，抗原检测灵敏度最高，达到 1×106 cfu/mL，且特异性强，重复性好，4 ℃ 保存 4 个月效价不变，室温保持 1 个月效价不变。乳胶凝集试验方法较直接玻片凝集法检 II II 测灵敏度高，但检测成本高于玻片凝集。 5.不同种类鳗鲡致病菌检测结果：3 种养殖鳗鲡共检测到致病菌 28 株，共同的致病菌 主要是嗜水气单胞菌，鳗弧菌主要感染欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡。11 株鳗鲡致病菌分别仅在一 种鳗鲡中检出，其中欧洲鳗鲡、日本鳗鲡、美洲鳗鲡分别占 5 株、4 株和 2 株，说明相当 数量的致病菌具有种类特异性。 6.不同季节鳗鲡致病菌检测结果：3 个季节共检测到 28 株致病菌，8 株全年流行，嗜 水气单胞菌是全年最主要的致病菌，但在不同季节检测到的具有血清型差异。13 株致病 菌在单一季节出现，包括春季 7 株，夏季 4 株，秋季 2 株，显示了较强的季节特异性。春 季主要致病菌是酸克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌（血清Ⅲ型，B18）和温和气单胞菌；夏季 主要嗜水气单胞菌（血清Ⅱ，B15）和鳗弧菌；秋季以嗜水气单胞菌（血清Ⅷ型，B31） 为主。 7. 不同地区鳗鲡致病菌检测结果：检测到 28 株鳗鲡致病菌，其中嗜水气单胞菌（不 同血清型）分布范围广，在 4 个地区均出现，鲁氏耶尔森菌和霍利斯弧菌只在闽南出现， 迟钝爱德华氏菌和溶解阴沟肠杆菌流行于闽西；10 株在 2 个不同地方同时检出；9 株致病 菌菌仅在单一地区出现，说明部分鳗鲡致病菌具有地域差异。 8. 不同规格鳗鲡致病菌检测结果：从 5 个规格共检测到 28 株鳗鲡致病菌，其中 8 株 在所有规格都能检出，共同的主要致病菌为不同血清型的嗜水气单胞菌、鳗弧菌和威隆气 单胞菌温和生物变种；7 株在单一规格检测到的致病菌中有 5 株出现在 10g 以下的鳗鲡， 它们是鲁氏耶尔森菌、霍利斯弧菌、腐败希瓦菌、1 株非发