闽江河口芦苇湿地硫酸盐还原菌的多样性研究.docVIP

闽江河口芦苇湿地硫酸盐还原菌的多样性研究 闽江河口芦苇沼泽湿地硫酸盐还原菌的多样性研究 【摘 要】为了深入揭示闽江河口芦苇湿地的硫元素代谢循环，采用 PCR-RFLP技术对芦苇湿地土壤表层的硫酸盐还原菌多样性进行了研究。在 构建的克隆文库中，随机挑取100个克隆进行菌落PCR验证，共得到97 个阳性克隆，阳性率为97%o阳性克隆的PCR产物利用限制性内切酶进行酶 切分析。结果表明，闽江河口芦苇湿地土壤表层的硫酸盐还原菌经RFLP 分析可得到20个不同的分类操作单元(OTUs),其中以OTU-2 (11) OTU -3 (23)、和 OTU -19 (19)为主。Shannon 多样性指数(H )和 Simpson 多样性指教(D)计算结果显示，土壤表层(0—10 cm)的Shannon指数 (H‘ )为 2.49, Simpson 多样性指教(D)为 0.114。 【关键词】硫酸盐还原菌；多样性；PCR-RFLP；芦苇湿地 引言(查文献进行修改)1000字 通过对闽江河口芦苇沼泽湿地硫酸盐还原菌的多样性研究，闽江沿岸 芦苇湿地土壤呼吸的昼夜变化和季节变化进行测量，结果表明:在最高水位 土壤表面未淹水的状态下,不同季节的土壤呼吸日动态没有一致的规律性， 土壤温度和土壤体积含水量不是土壤呼吸FI变化的主要影响因子;而在最 高水位土壤表面淹水的状态下，水位对土壤呼吸强度有一定影响:当土壤表 面被淹没时，土壤呼吸强度约为0；当水位下降时，土壤呼吸强度增加?土壤呼 吸的季节变化呈单峰形式,5 cm处土壤温度仅能解释土壤呼吸季节变化的 49.4%,而土壤体积含水量对土壤呼吸季节变化无显著影响. 有关湿地硫循环的相关研究进展(补充) 有关硫酸盐还原菌的研究进展，特别是湿地土壤屮硫酸盐还原菌的相 关研究进展(补充) 本研究从闽江河口芦苇湿地土壤中提取微生物宏基因组DNA,利用 DSR引物用于扩增硫酸盐还原菌的dsrAB基因，利用胶回收试剂盒进行 dsrAB基因基因的回收及纯化，同时构1 建克隆文库，进行RFLP分析，为进一步研究河口湿地土壤硫酸盐还原 菌多样性提供理论基础。 材料与方法 2.1主耍仪器和试剂 2.1.1主要仪器： PCR扩增仪、自动凝胶成像分析仪、冷冻高速离心机、台式高速离心 机、核酸电泳仪、涡旋混合仪、低温冰箱、高压蒸气灭菌锅、超微量紫外 分光光度测定仪、超净工作台、恒温震荡摇床、恒温震荡摇床、移液枪等。 2.1.2主要试剂： 土壤DNA提取试剂盒、琼脂糖、Tag DNA聚合酶、EB、200bpDNA Ladder、 50bpDNA Ladder、Promega胶回收试剂盒、LB液体及固体培养基等，以 上生化试剂大多为分析纯。 土壤总DNA的提取 准确称取0.25 g 土壤釆用土壤DNA提取试剂盒(MO BIO Laboratories, USA),按厂家操作说明书的方法进行土壤总DNA的提取和纯化。DNA纯 度和浓度通过紫外分光光度计(NanoDrop, USA)进行检测，收集的DNA样 品在分析和PCR扩增之前存于一20 °C备用。 dsrAB基因的扩增及纯化 以提取的土壤总DNA为模板用于扩增大约1900 bp的dsrAB基因片段, 扩增引物采用硫酸还原菌的特异性引物DSR1F： (5‘ -AC[C/ G]CACTGGAAGCACG-3,)和 DSR4R： (5‘ ?GTGTAGCAGTTACCGCA-3, ) [134]□ PCR反应体系为50 M L： 10XPCR缓冲液5 M L, dNTP4 PL,引物各1 P L, 0.5 uLrTaq 酶，DNA 模板 1 u L,加灭菌的 ddH2O 至 50 卩 L。 PCR反应条件:94 °C预变性5 min； 94 °C变性45 S, 58 °C退火45 S, 72 °C延伸2.5 min, 33个循环；最后72 °C延伸7 min。扩增的PCR反应 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下切下含冃的DNA片断的凝胶 条带，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(Promega, USA),按厂家说明书的 方法进行dsrAB基因的回收纯化。 dsrAB基因克隆文库的构建 纯化后的dsrAB基因片段按厂家说明书的方法与pMD18-T vector (Takara,大连)连接。连接体系pMD 18-Tvector 1 u L,目的基因2 u L,灭菌的 ddH2O2 M L, Solution I 5 P L,总体积 10 P L。16 °C过夜连接 后，转化入E. coliDH5a感受态细胞。转化产物涂布到含有氨节青霉素 (Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上,37 °C下培养16-24 h,通过蓝 白斑筛选方法筛选重组子，白色克隆子即为阳性转化子。挑