负载HER―2的树突状细胞诱导T细胞对骨肉瘤杀伤活性的研究.docVIP

负载HER-2的树突状细胞诱导T细胞对骨肉瘤杀伤活性的研究 摘要：目的研究用HER-2抗原负载树突状细胞诱导T淋巴细胞对骨 肉瘤细胞系U2-0S的杀伤活性。方法 用HER-2抗原肽段E75369-377(HER-2 组)、PBS (PBS组)分别负载PBMC来源的树突状细胞，与T淋巴细胞共培 养7d后检测各组T细胞穿孔素的表达，通过LDH释放法比较两组T细胞 对U2-0S的杀伤活性。结果HER-2组的T细胞表达穿孔素高于PBS组 (P0. 01)； IIER-2组的T细胞对U2-OS的杀伤率高于PBS组(P0. 01)。 结论用HER-2抗原肽E75369-377负载树突状细胞诱导T细胞能提高对骨 肉瘤细胞系U2-0S的杀伤效率。 关键词：树突状细胞；HER-2；骨肉瘤；免疫治疗 负载肿瘤抗原的树突状细胞可以诱导T淋巴细胞对肿瘤细胞产生特异 性杀伤免疫效应[1],据此我们用人类表皮生长因子受体2 (HER-2)负载 人树突状细胞诱导同源的T淋巴细胞，观察其对人骨肉瘤细胞系U2-0S的 杀伤活性。 1资料与方法 1. 1 一般资料 骨肉瘤细胞株U2-OS购自中国科学院上海细胞库;IIER2 (E75369-377)肽段购自上海强耀生物科技有限公司；rhGM-CSF. IL-4和 TNF-a购于PeproTech公司；重组人白细胞介素-2 (rhIL-2)购于北京双 鹭药业股份有限公司；Anti-Human HLA-DR APC购于美国BD公司; Permeabilization Kit购于ADG公司;CytoTox96?非放射性细胞毒性检 测试剂盒购于美国Promega公司。 1.2方法 1. 2. 1 DC的分离、培养、及鉴定 从健康成人屮筛选岀5名HLA-A2表 型阳性的志愿者，抽取外周血10ml,用Ficoll密度梯度离心法［2］提取外 周血单个核细胞(PBMC),细胞计数平均在5X 107-7X 107个；用贴壁法 分离出单核细胞，悬浮的淋巴细胞冻存备用。单核细胞用含800U/ml GM-CSF 和500U/ml IL-4的1640培养基培养，添加15%的无支原体胎牛血清(FBS), 诱导其向树突状细胞(DC)分化。培养第5d时加TNF-a 100ng/ml刺激DC 成熟。培养至第7d收集细胞105个，用流式抗体APC-HLA-DR标记，同时 设置阴性对照，在流式细胞仪上检测成熟DC表面分子标记。 1.2.2用HER-2抗原负载DC收集成熟DC,取1X 106个细胞，离心后 用2ml含GM-CSF和1L-4的1640培养基重悬，细胞悬液等分为2份，转 移到 2 支 5mlEP 管屮，分别加 HER-2 抗原肽 E75369-377 (2mg/ml) 20ul (HER-2组)、PBS 20ul (PBS组)，摇匀后在37°C、5%C02培养箱中孵育 4h,期间每30niiri摇匀一次。然后加PBS3ml离心,用淋巴细胞培养基2nd 重悬。 1. 2. 3诱导抗原特异性T细胞 提前Id复苏同源的淋巴细胞，用1640 培养基(添加15%的FBS)在37°C、5%C02培养箱屮培养一天，观察细胞 状态。取IX 107个淋巴细胞，按DC： T为1： 10的比例分别与HER-2组 和PBS组的DC悬液混合，同时加入细胞因子IL-2 (500U/ml)o在37°C、 5%C02培养箱中共培养7d诱导抗原特异性T细胞，每2天补液lnil,并相 应添加IL-2o 1. 2. 4检测T细胞穿孔素的表达 收集HER-2组和PBS组经DC诱导的 T细胞，每组取106个细胞到流式分析管中，用PBS 3ml洗一遍后加100 固定液，混匀后室温避光孵育15min；然后加3ml的PBS洗一遍，弃尽上 清;然后加入100ul破膜剂，再加流式抗体Anti-Perforin PE 5ul,混匀 后避光室温孵育15min；加3ml PBS洗一遍，然后弃尽上清;用1 OOul PBS 重悬细胞，在流式细胞仪上检测T细胞穿孔素的表达。 1. 2. 5乳酸脱氢酶(LDII)释放实验检测T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤率 用CytoTox 96R非放射性细胞毒性检测试剂盒，按照说明书操作。收集 HER-2组和PBS组经诱导的T细胞作为效应细胞；取对数期牛长的U2-0S 细胞，调整密度为1.0X105/ml；将T细胞与骨肉瘤细胞U2-0S按40： 1、 20： K 10： 1的比例分别加入96孔板屮，每组设3个复孔，同时设T细 胞自然释放孔、U2-0S细胞自然释放孔、U2-0S细胞最大释放孔，在37°C、 5%C02培养箱里共孵育6h,酶标仪测定波长490nm的吸光度。按以下公式 计算杀伤率，杀伤率(%) = (E-S1-S2) / (M-Sl) X100%,其中E二实验孔