利用滤除白细胞分离培养NK细胞方法的优化-内科学专业毕业论文.docxVIP

山西医科大学硕士学位论文 山西医科大学硕士学位论文 利用滤除白细胞分离培养 NK 细胞方法的优化 摘 要 目的： 利用制备血制品过程的滤除掉的淋巴细胞经体外诱导扩增 NK 细胞，对 NK 细胞 的分离培养方法进行优化，并对培养以后所获得的 NK 细胞的功能和活性进行检测， 为非自体 NK 细胞的临床应用提供实验室研究数据。 方法： 收集山西省血液中心 2014 年 3 月至 2014 年 11 月期间 15 例健康献血者的新鲜外 周血，将制备血液制品后废弃的滤除白细胞回收，经过密度梯度离心法获得外周血中 单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），每份样本分为 3 组，A 组：培养瓶预先包被 CD3mAb；B 组：培养瓶预先包被 CD16mAb；C 组：培养瓶预 先包被 CD16mAb 和 CD3mAb，相同培养条件下，加入相同无血清细胞培养液和细胞 因子 IL-2 和 IFN-γ诱导扩增。扩增第 0、8、12、17 天高倍镜下看细胞长势并计算细 胞扩增倍数，用流动检测细胞技术检测细胞表型为 CD3-CD56+的细胞比例的变化，选 择 NK 占比最高的 B 组细胞成为实验对象，分别测定培养第 0 天和第 17 天 B 组 NK 细胞表面高活性受体（NKp30、NKp46、NKG2D）的表达及细胞杀伤因子 IFN-γ的分 泌水平，培养第 17 天采用 LDH 释放法及流式细胞术检测 B 组 NK 细胞对恶性细胞 K562 和 Raji 细胞的细胞毒作用。 结果： 比较诱导培养第 17 天与培养第 0 天的 CD3-CD56+细胞占比的变化情况，A 组为 [（15.19±12.22）% vs（16.34±10.51）%，p＞0.05]，差异无统计学意义，B 组为 [（83.63±10.63）% vs （16.34±10.51）%，p＜0.05]，C 组为[（49.40±12.64）% vs （16.34±10.51）%，p＜0.05]，B 和 C 组培养第 17 天的 CD3-CD56+细胞比例均较第 0 天显著增加，差异具有统计学意义；第 17 天 CD3-CD56+细胞比例 B 组比例显著高于 A 和 C 组；三组 NK 细胞总数均大于 109 个；检测 B 组培养第 17 天 NK 表面活化性 I II II 受体 NKp30 和 NKp46 的表达比例均比第 0 天显著增高，NKG2D 比例变化无统计学 意义；B 组扩增的 NK 细胞对 K562 细胞和 Raji 细胞均具有杀伤能力，对 K562 细胞 具有较高的杀伤能力。 结论： 制备血液制品后滤除掉的白细胞，安全可靠，无病原体污染，经体外分离培养后， 可得到比例高达 90%的 NK 细胞，其总数大于 109 个，细胞杀伤能力增强，对恶性肿 瘤细胞具有较高杀伤能力，达到临床治疗恶性疾病的应用标准，滤除白细胞有希望成 为临床非自体 NK 细胞防治恶性肿瘤的一种细胞来源；NK 细胞扩增过程中经过密度 梯度离心法分出外周血单个核细胞，再添加单克隆抗体和细胞因子诱导扩增，培养过 程简便，成本较低，适用于临床大规模应用。 关键词：NK 细胞；同种异体；血液制品；分离培养 PAGE PAGE III Optimization of the method to cultivate NK cells from abandoned white cells Abscract Objective： Using abandoned white cells separated from preparation of blood production to cultivation NK cells in vitro , and testing the function of the NK cells, optimize the method of cultivation allogeneic NK cell for clinical application. Methods： Abandoned white cells separated from blood production were collected from Shanxi Blood Center during March to November 2014, 15 cases of healthy donors; PBMCs were isolated from the abandoned white cells and cultured for 17 days using culture bottles as previously coated Antibody(group