里氏木霉的紫外诱变和高活性纤维素酶突变株的选育-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 中 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业 科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：舅动金番o ’J 删／年形月c79日 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版， 允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于： 1、 保密口，在年解密后适用本授权书。 2、 不保密瓯 (请您在以上相应方框打“4) 作者签名：髯硷n 导师签名：彳可钢 硼e 1年％具呕B 切t 1年乡月7日 摘以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质原料数量丰富，发展和利用 摘 以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质原料数量丰富，发展和利用 生物质能源是实现经济、社会可持续发展的有效途径。在生物质原料转化利用方 面，里氏木霉(Trichoderma reesei)是产纤维素酶的重要菌种之一，其生产的纤 维素酶在能源、生物防治、食品等多个领域都得到了广泛的应用。本研究通过对 里氏木霉进行紫外诱变，以筛选出高产纤维素酶的突变菌株，进一步提高其纤维 素酶的产量，降低生产成本为目的。 本文基于筛选高产纤维素酶突变菌株的目的，对罩氏木霉Rut C30进行紫外 诱变，筛选突变菌株，并对其突变菌株的产酶条件进行优化，通过随机扩增多态 性DNA(RAPD)对出发菌株和突变菌株的基因组进行分析。 对T．reesei Rut C30的孢子悬液进行紫外线诱变，确定最佳诱变时间为40s， 该剂量下致死率为83．500％，正突变率为8．679％，以刚果红筛选培养基上水解圈 与菌落直径的比值(H／d)为指标，进行初筛，再以液体发酵产酶进行复筛，最终 获得了一株突变株A13，其滤纸酶活为4．328U／ml，相较于出发菌株2．786U／ml 的酶活，提高了55．350％。对突变株A1 3进行6代连续培养，酶活稳定在4．1 60U／ml， 其遗传稳定性较好。 通过碳源、复合氮源、产酶温度这三个单因素优化实验，获得了突变菌株Al 3 产酶的最佳条件，以1．000％微晶纤维素为碳源、0．1 50％蛋白胨与O．050％硫酸铵 为复合氮源，产酶温度为28℃的条件下，突变菌株A1 3的滤纸酶活为4．91 5U／ml， 比优化前的4．1 60U／ml提高了1 8．1 50％。 在含有微晶纤维素的产酶培养基中添加适量的麦芽浸粉，实验表明，麦芽浸 粉确实能促进里氏木霉的突变株产出更多的纤维素酶。当在1．000％微晶纤维素的 基础上添加1．000％麦芽浸粉时，滤纸酶活提高到了5．720U／ml。采用中心复合实 验设计，寻找微晶纤维素与麦芽浸粉的最佳配比。对中心复合实验设计的实验结 果进行响应面分析，结果表明，在优化后的产酶条件下，当微晶纤维素和麦芽浸 粉分别为1 3．1 99／L和11．039／L时，实际测定的滤纸酶活可以达到5．986U／ml，接 近软件预测的最大值6．082U／ml。 对出发菌株及4株突变菌株的基因组DNA进行RAPD分析，并对RAPD．PCR 的反应体系进行优化。筛选出6个随机引物后，对它们的扩增条带进行聚类分析， 的反应体系进行优化。筛选出6个随机引物后，对它们的扩增条带进行聚类分析， 结果显示这5株菌的遗传相似系数在O．60465 1 2．0．8837209之间，表明它们之间有 较近的亲缘关系，但存在一定的遗传变异。 关键词：里氏木霉；纤维素酶；紫外诱变；优化；随机扩增多态性DNA II ABSTRACTBiomass ABSTRACT Biomass in the form of cellulose，hemicellulose and lignin exists in large quantities．It is an effective way to achieve sustainable development of economic and society by developing and utilizing biomass energy．On conversion and utilization of biomass raw material，Trichoderma ree