利用DNA芯片对盐酸克伦特罗减少猪脂肪积累分子机制的初探-生物化学与分子生物学专业论文.docx

摘要我国是一个养猪大国，地方猪品种沉积脂肪的能力强，这大大影响了猪的经济价值。盐 摘要 我国是一个养猪大国，地方猪品种沉积脂肪的能力强，这大大影响了猪的经济价值。盐 酸克伦特罗(Clenbuterol-HCL，CLB-HCL)，俗称“瘦肉精”，是一种13．兴奋剂，可以显著 减少猪脂肪积累，但由于其不易被分解，在动物体内残留时间跃，人食用含有CLB—HCL的 猪产i}占可能导致中毒而被禁止使用。为了解CLB．HCL减少猪脂肪沉积的分子机理，我制利 用自制的cDNA基因芯片对饲喂CLB．HCL的实验用小型猪(共八只，全同胞配对分为四组 生物学重复，每蛆两只猪中一只饲喂CLB-HCL，另一只不饲喂CLB—HCL)脂肪组织进行 基因表达谱分析，利用Affymetrix Porcine Genome芯片对饲喂CLB-HCL后瘦肉率提高超过 10％的两组实验用小型猪的肝脏组织进行基因著异表达谱分析，并且利用Affymetrix Rat Expression Set 230A芯片对CLB-HCL刺激体外培养的脂肪细胞进行基因表达谱分折。 在实验用小型猪脂肪组织差异表达基因中，与G、蛋白耦联信号通径相关的两个基因 “cAMP依赖的蛋白激酶类型l调控因子”(GenBank登陆号：X05942)和“小GTP结台 蛋白rab30”fGenBank登陆号：U57092)的转录水平分别上调2,0倍和2．23倍，我』推断它们 是CLB．HCL作用B．肾上腺素受体后传递信号的分子。还发现与脂类代谢相关的载脂蚩白D (aoplipoproteinD)和载脂蛋白R(aoplipoproteinR)转录水平分别上调2．20倍和2 24倍，硬 腊酰辅酶A去饱和酶(stearoyl．CoA desaturase，SCD)基因的转录水平F调为0 41倍，这些 变化可能与饲喂CLB-HCL导致实验用小型猪脂肪积累减少密切相关。此外，与胶原蛋白相关 的9个克隆代表着胶原I的o l和n 2以及胶原III的Q 1三个基因，转录水平全部晕现上 调2倍以上。这可能标志着前脂肪细胞向脂肪细胞分化作用的减弱。在脂肪组织差异表达基 因中有9条EST序列在美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information。NCBI)中比对不到同源序列(2005年10月)，它们可能是与脂类代谢密切相关 但还不被人们了解的新基因。荧光定量PCR试验证实以上结果中载脂蛋白D、硬脂酰辅酶A 去饱和酶和EST rpfat 15972三条基因，在饲喂CLB—HCL组与对照组差异表达均超过2倍。 对肝脏组织研究发现，饲喂CLB-HCL后，276条基因表达发生2倍以上变化(158条上 调表达，118条下调表达)，对于差异表达的276条基因，按照欧洲生物信息学中心(European Bioinformationtic Institute)提供的基因本体(gene ontology)信息进行分子功能(molecular function)分类，其中具有结合(binding)ll条，催化活性(camlytic activity)27条，防御 免疫活性(defense immunity activity)8条，信号转导活性(signal transducer activity)4条和 转运活性(transportor activity)9条，没有分类信息的212条。在具有催化活性的27条基因 中，与羧基脱氢酶1(GenBank登陆号：NP 001748．1)基因中度相似的EST加强表达3 94 倍，羧基脱氢酶l参加前列腺素(prostaglmldin，PO)的合成，PG可以导致腊解作用加强； 还有碘甲腺原氨酸脱碘酶类型I(GenBank登陆号：NM 001001627．1)基因上调表达2．8l， 它编码的酶催化甲碘甲腺原氮酸(T4，3，5，3’，5-tetraiodothyronine)转化为具有生物活性的甲 状腺素，甲状腺素具有刺激脂肪减少，肌肉增加的作用。此外，具有信号转导活性的4条差 异表达中，有三条基因与G蛋白有关，它们是G蛋自信号调控予1(GenBank登陆号： AFl39837 1)，和两条EST与G蛋自信号调控子18(regulator of G-protein signalling 18)中 度相似。对以上结果选取6条基因，采用荧光定量PCR验证，吻台度达到100％。 在CLB．HCL刺激体外培养的大鼠脂肪细胞试验中，我们得到差异表达基因508条，上 在CLB．HCL刺激体外培养的大鼠脂肪细胞试验中，我们得到差异表达基因508条，上 调基因271条，下调基因237条，其中68条上调基因和72条下调基因功能已知。在这些已 氮J功能的差