卵子及活检后人胚胎玻璃化冷冻的实验研究-生殖内分泌专业论文.docx

中山大学博士论乏 中山大学博士论乏 塑兰垒兰竺墨仝竺堕苎壁坐全堡竺壅坠竺垄 ±查塑墨 卵子及活检后人胚胎玻璃 化冷冻的实验研究 博士研究生： 郑闻亭 导 师：庄广伦教授 专 业： 生殖内分泌 中L“大学附属第一医院妇产科生殖医学中心510080 中文摘要 在当代的辅助生殖领域，卵子(卵母细胞)冷冻是一项极具价值和吸引力的技 术。成功冷冻卵子可以帮助绝经后妇女及恶性肿瘤患者恢复生殖能力，重新开始生 育计划。虽然在IVF中使用冷冻的卵子已获得妊娠和分娩，但仍然是个案报道，目 前尚不存在一个公认的冷冻卵子的方案，卵子冷冻结局仍欠稳定。越来越多的研究 报告表明玻璃化冷冻方法是保存哺乳动物和人类卵子、胚胎和囊胚的简便快速、低 廉、高效实用的方法。玻璃化冷冻不会产生细胞内冰晶，而且还可以减少包括冻伤 在内的各种卵子的胞浆内的生物学变化。玻璃化冻存人卵已有成功妊娠的报道，在 我国玻璃化冷冻人卵的研究尚未取得妊娠成功。 此外，在辅助生殖临床工作中，经过种植前诊断的胚胎有时在新鲜移植周期中 过剩，而需要进行冷冻。但是采用目前的标准程序化慢速冷冻方案将造成其冻存率 极低，活检为何造成人胚胎的冻存率下降的机理仍不清楚。仅有一篇文献报道成功 冷冻活检后人胚胎，但未能解释他们所采用的改良程序化方案为何能够提高活检后 人胚胎冻存率。玻璃化冷冻活检后人胚胎的结局尚未见报道。 据此，本研究以玻璃化冷冻方法为主题，探讨人卵子及活检后人胚胎最佳的冷 冻方案： 卵子及活检后人胚胎玻璃化冷冻的实验研究 卵子及活检后人胚胎玻璃化冷冻的实验研究 中文摘要 第1章卵子玻璃化冷冻的实验研究 目的：了解使用不同冷冻方案下的卵子冻存率和冻后发育潜能，及其在在冷冻 过程中所发生的细胞不良病变，探索玻璃化冷冻是否是适合卵子冷冻的方法以及有 效方案。 材料和方法：由于人MII卵子珍贵难获，本实验采用小鼠的MII卵子、体外成 熟培养的人MII卵子、IVF第3天未受精的人卵子进行研究。将所获得的一部分卵 子进行冷冻保护剂渗透压存活实验。一部分卵子行玻璃化冷冻和程序化慢冻的对照 研究：计数和统计各种冷冻方案的冻存率，及冻存卵子人工孤雌激活(用氯化锶+ 细胞松弛素D)或体外受精发育为卵裂胚、囊胚的效率。使用透射电镜检查玻璃化 冻存卵子的超微结构的变化，激光共聚焦显微镜检查卵子纺锤体在玻璃化冷冻后的 变化．倒置显微镜观察玻璃化冷冻造成卵子孤雌激活的情况。 结果：共用1508个小鼠MII卵和339个人卵进行了本实验。 (1)小鼠卵玻璃化冷冻比程序化慢冻冻存率显著提高(16～30％VS 96～i00， P0．0005)；人卵玻璃化冻存比程序化慢冻具有冻存率提高的趋势(22～72％VS 75～100％)随着冷冻液中蔗糖浓度的升高，程序化慢冻人卵的存活率显著提高 (户O．021，PO．0005)；小鼠卵程序化慢冻存活率低，小鼠卵和人卵具有一定程 度的不同特性。 (2)玻璃化冷冻后的卵子皮质颗粒减少，但可以体外受精：冻融小鼠卵受精率 为87％(41／48)，与未冷冻组(69％，37／54)比较无显著差异(卢O．061)；玻 璃化冷冻的小鼠卵子受精后具有正常的的囊胚形成率，为76％(P=O．595)；人卵受 精率低，为43．8％，但可能与卵子体外成熟透明带厚有关。 (3)玻璃化冷冻后卵子纺锤体可以恢复正常结构。未冷冻小鼠卵86％(31／36) 正常，玻璃化冷冻小鼠F月78％(32／41)『E常(P=O．393)，余超微结构有无肿胀 与稀释冷冻保护剂的速率有关。如果解冻稀释过程过快，胞浆细胞器肿胀并形成胞 浆空泡，但不影响鼠卵种植前囊胚形成率和细胞数。 (4)玻璃化冷冻不造成小鼠卵孤雌激活率显著升高。未冷冻组孤雌激活率为8 ％(4／50)，玻璃化冷冻组为11～22％(5／47和10／45)(P=O．736和O．08)。 SrCl。+CD人工孤雌激活小鼠MII卵形成囊胚效率与体外受精者相同，分别为88％(30 11 卵子及活捡后人胚胎玻璃化冷冻的实验研究 卵子及活捡后人胚胎玻璃化冷冻的实验研究 中丈摘要 ／54)和81％(38／47)，户O．532。 (5)卵子具能较好的耐受渗透压变化的能力，但在高浓度的保护液中停留时 间过长导致死亡：小鼠MII卵在1．5 mol／L PROH+0．2 mol／L慢冻液中10 min内， 存活率9()％；超过20min，存活率17％，差异有显著性(尸0．0005)。在l，5 mol／L PROH+0．3 m01／L慢冻液中4 min内，存活率85％，超10 min，存活率≤50％， 差异有显著性(PO．0005)；在15％EG+15％DMSO玻璃化预平衡液中15 min之 内，存活率85％：超过20 min，存活率40％，差异有显著性(PO．0005)； 在30