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摘要
摘要
卤醇脱卤酶参与了环境中含卤化合物的生物降解过程。它通过分子内亲核取 代机制催化邻卤醇到环氧化物的转化,并可在不同的亲核试剂介导下催化环氧化 合物的开环反应,因此可用于具有光学纯的环氧化物及 β-取代醇等一类高价值手 性药物中间体的合成。然而,卤醇脱卤酶只对有限的底物范围展现出高立体选择 性,这种底物依赖的立体选择性通常不适用于特定底物的工业生产过程。为拓宽 其底物范围及应用潜能,理性设计及分子定向进化已用于酶的改造。
酶的改造关键之一在于突变文库的构建。通过将正交矩阵优化与大引物 PCR 方法相结合,不仅可以对多个位点进行饱和突变而且可以在不需要酶切连接的可 控条件下进行随机易错突变。在对 HheC 活性位点周围氨基酸的突变实验中发现 四个 Loop(P84-Loop,W139-Loop,Y187-Loop 和 W249-Loop)协同作用,共同参 与了酶催化过程中活性位点构象的变化。其中,关键的氨基酸 P84,W139,W249 和 Y187 通过氢键及范德华力相互作用,对酶的 kcat 和 Km 值表现出不同的加和效 应,以及底物依赖的环的柔性的变化。而基于结构认识的定点突变及饱和突变, 在底物结合口袋位点氨基酸 T134,W139 和 Y187 的高通量筛选中,得到立体选 择性成功逆转的突变体 T134A/W139Q/Y187F,其立体选择性由野生态的 ER=59 变为 ES=3。此外,卤离子的释放作为脱卤反应的限速步骤,要求卤素结合位点 环(Y187-Loop)发生柔性的重排,催化机制的量子化学模拟显示该环涉及到整个底 物转化过程的立体选择性和区域选择性。CASTing 方法用于该环上三个保守脯氨 酸(P175,P184 和 P188)的功能突变,结果表明脯氨酸通过改变环的运动影响脱卤 及开环反应的立体选择性,并实现底物依赖和位点依赖的的立体选择性的提升及 逆转,拓展了 HheC 在手性药物合成中的应用范围,为以后的深入研究奠定了一 定基础。
关键词:卤醇脱卤酶;大引物 PCR;加和效应;立体选择性;脯氨酸;柔性。
I
ABSTRACT
ABSTRACT
Halohydrin dehalogenase from Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC) catalyzes not only the dehalogenation of vicinal halohydrins to epoxides by an intramolecular nucleophilic displacement mechanism ,but also their reverse ring-opening reactions with alternative nucleophiles as substrates, both of which reactions were proven to proceed with high enantioselectivity and regioselectivity, making these enzymes valuable tools for the production of optically pure epoxides and β-substituted alcohols. These compounds constitute one of the most important classes of building blocks for the synthesis of chiral drugs. However, the enantioselectivity of HheC is substrate-dependent, and is not always enough
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